بخشی از مقاله
چکیده :
بیماري پوسیدگی ریشه و زوال خربزه و هندوانه با عاملMonosporascus cannonballus یکیاز مهمترین بیماریهاي این گیاهان و خانواده آنها می باشد. هدف از این تحقیق شناسایی پاتوژن مولد این بیماري با استفاده از روشهاي کلاسیک و ملکولی می باشد. در سالهاي 89-88 از مناطق مختلف کشور مانند استانهاي سمنان، یزد، اصفهان، فارس، خراسان، سیستان وبلوچستان و قزوین از بوته هاي هندوانه ، خربزه ، طالبی و گرمک با علائم زردي، پژمردگی و بوته میري نمونه هاي گیاهی جمع آوري گردید و قارچ عامل بیماري M. cannonballus بر اساس خصوصیات مرفولوژیکی جداسازي و شناسایی شد - . - 7
از آنجائیکه تشخیص این بیماري بر اساس خواص مرفولوژیک با مشکلاتی همراه می باشد یکسري آزمایشات ملکولی با پرایمرهاي اختصاصی بهمراه DNA که تولید باند مشخص قابل پیش بینی می کند، اقدام گردید. بدین منظور DNA جدایه ها استخراج شد و با استفاده از پرایمر اختصاصی در واکنش زنجیره پلیمراز مورد استفاده قرار گرفتند که در نتیجه بر روي ژل آگارز قطعه اي با اندازه تقریبی 112 جفت باز تکثیر و مشاهده گردید. توالی قطعه تکثیر شده با توالی هاي M. cannonballusواقع در سامانه اطلاعاتی %96 NCBI همولوژي نشان داد. بر اساس آزمایشات انجام شده، این تحقیق تائید کرد که عامل بیماري از بوته هاي هندوانه ، خربزه ، طالبی و گرمک آلوده با استفاده از پرایمر اختصاصی قابل شناسایی است.
واژهاي کلیدي Monosporascus cannonballus: ،DNA ، زنجیره پلیمراز ، ابزار ملکولی
مقدمه :
هندوانه، خربزه، طالبی و گرمک از خانواده کدوییان - Cucurbitaceae - می باشند و بعنوان محصولات با ارزش در اکثر کشورهاي جهان معرفی می گردند. بیماریهاي مختلفی تولید این محصولات را دچار مشکل میکنند. پوسیدگی ریشه و زوال بوتهها یک بیماري مخرب است که رشد و تولید کدوئیانی چون هندوانه و خربزه را شدیدا در مناطق گرم و خشک جهان محدود کرده است . - 5 - این بیماري از مهمترین بیماریهاي هندوانه ، خربزه ، طالبی و گرمک در ایران میباشد و علائم این بیماري معمولا 2-1 هفته مانده به برداشت محصول ظاهر شده و بیشترین خسارت وقتی ایجاد می شود که گیاه تحت استرسهاي گرما و خشکی بویژه در موقع رسیدگی میوه باشد . - 4 - عامل بیماري M. cannonballus از قارچهاي رده Sordariomycetes می باشد. این قارچ بومی مناطق گرم و خشک بوده و در شرایط کم باران به صورت همه گیر در می آید. بیمارگر در مرحله رویشی به صورت میسلیومی بوده و فاقد اسپورهاي غیر جنسی - کنیدیوم - می باشد.
در مرحله جنسی - تلمورف - تولید آسکوکارپی از نوع پریتسیوم می نماید. پریتسیوم حاوي آسکهاي فراوان و هر آسک حاوي یک آسکوسپور است - . - 7 آسکوسپورها داراي دیواره ضخیم می باشند که تا مدتها در خاك دوام می آورند . - 5 - این قارچ در ایران M. cannonballus اولین بار از روي طالبی و خربزه از مناطق زابل، گرمسار و ایوانکی گزارش و بیماریزایی آن اثبات گردید - . - 11 شناسایی بیمارگر صرفا بر اساس ویژگیهاي مرفولوژیکی دشوار می باشد. M. cannonballus در مرحله رویشی فاقد اسپورهاي غیر جنسی بوده و تنها راه قابل اطمینان جهت تشخیص این بیمارگر آسکوسپورها می باشد که بعد از زمان نسبتا طولانی تحت شرایط خاص در برخی از سویه هاي این قارچ تولید می شوند. تشخیص به موقع این بیماري براي ارائه راه هاي کنترل آن بسیار مهم می باشد، به کارگیري مارکر هاي ملکولی امکان تشخیص سریع این قارچ را ظرف 2-1 روز از بافتهاي آلوده در مراحل اولیه آلودگی و نیز خاك مزارع آلوده فراهم آورده اند.
در قارچ M .cannonballus پرایمرهاي اختصاصی تهیه شده اند که اختصاصا جدایه هاي این بیمارگر را که از نقاط مختلف دنیا جمع آوري شده بودند، شناسایی نموده اند 5 - و. - 9 پیکو و همکاران - 2008 - ضمن تائید این پرایمرها در تشخیص اختصاصی M. cannonballus نشان دادند که یک جفت از این پرایمرها با حساسیت فوق العاده بالایی قادر به شناسایی این گونه از بافتهاي آلوده می باشد . - 7 - در این بررسی، امکان به کارگیري این مارکر ها در شناسایی جدایه هاي ایرانی قارچ عامل بیماري مذکور مورد آزمایش قرار گرفت تا با تشخیص سریع، بویژه در سالهاي کم باران که امکان طغیان این بیمارگر بالاست، با تمهیدات به موقع از میزان خسارت آن کاست.
مواد و روش ها :
در سالهاي 89-88 در بازدید از مزارع هندوانه، خربزه، طالبی و گرمک در مناطق مختلف کشور مانند استانهاي سمنان، یزد، اصفهان، فارس، خراسان، سیستان وبلوچستان و قزوین بوته هاي مشکوك به بیماري جمع آوري شدند. ریشه هاي داراي علائم پس از ضد عفونی سطحی بر روي محیط PDA حاوي آنتی بیوتیک و CMA کشت شدند. پلیتها در دماي 28 الی 30 درجه سانتیگراد نگهداري و شناسایی بر اساس تولید پرتیسیوم و آسکوسپور انجام شد - . - 8 و به منظور اثبات بیماریزایی مایه قارچ در فلاسکهاي حاوي بستر ماسه، یولاف و پرلیت تهیه و در دماي 28 درجه سانتیگراد به مدت چهار هفته نگهداري شدند . - 1 - و پس از اثبات بیماریزایی و به منظور جداسازي DNA از توده میسلیومی جدایه هاي M. cannonballus بیماریزا جدایه ها برروي محیط مایع FCM کشت شدند DNA
. - 3 - جدایه ها بوسیله ازت مایع طبق روش ریدر و برودا استخراج گردیدند - . - 10 سپس با استفاده از پرایمر فوق الذکر در شرایط توصیفی توسط پیکو و همکاران PCR شدند - . - 7 پرایمر اختصاصی مورد استفاده در این آزمایش بشرح ذیل میباشد:و سپس محصول PCR با استفاده از ژل آگاروز الکتروفورز شده و باندهاي با اندازه مورد نظر 112 - جفت باز - بوسیله دستگاه ژل داك مشاهده شدند. توالی نوکلئوتیدي حاصل با استفاده از سامانه اطلاعاتی national center for biotechnology - NCBI - information جهت حصول اطمینان از تطابق قطعه تکثیر شده DNA حاصل از سویه هاي ایرانی M. cannonballus با توالی هاي نوکلئوتیدي M. cannonballus منتشر شده در سامانه اطلاعاتی مذکور مقایسه شدند.
نتایج و بحث :
علائم روي بوته ها شامل زردي عمومی در برگهاي طوقه اي، پژمردگی و در بوته هایی که بیماري در آنها پیشرفت کرده بود، برگها نکروزه و تمام تاج گیاه 1-2 هفته مانده به برداشت محصول از بین می رفت و نیز نقاط نکروزه روي سطح ریشه ها وجود داشتند. جدایه ها در محیطPDA فاقد شکل کنیدیومی بوده و این جدایه ها بصورت میسلیوم هاي بیرنگ رشدکرده وهیچ نوع اسپر غیرجنسی تولید نکردند. بعد از گذشت 25 الی 30 روز بر روي محیط CMA در انکوباتور با 30 °C آسکوکارپهایی از نوع پرتیسیوم تشکیل دادند. پرتسیوم ها کروي با دیواره صاف و بدون زائده بوده و با مختصري فشار از پهلو شکافته و آسکهاي فراوانی از آن خارج می شدند. آسکها چماقی ، داراي پایه کوتاه، یک جداره ضخیم و داراي فقط یک آسکوسپور بودند. آسکوسپورها کاملا کروي و رنگ آنها از بیرنگ تا قهوه اي تیره متغیر بود.
مشخصات این قارچ با گونهM.cannonballus همخوانی دارد - . - 8 این جدایه ها پس از مایه زنی سبب بروز علائم زردي و نکروز برگ در بوته هاي مایه زنی شدند. بعد از خالص سازي جدایه ها و کشت آنها داخل فلاسک هاي داراي محیط FCM پس از گذشت دو هفته قارچ سطح فلاسک را پر کرد. با انجام PCR با استفاده از DNA هاي حاصل و پرایمر اختصاصی، بر روي ژل آگارز 1/2 درصد یک قطعه DNA با اندازه 112 جفت باز مشاهده شد. با بلاست کردن نوکلئوتیدها توالی بازهاي قطعه تکثیر شده با توالی هاي موجود در بانک اطلاعاتی national center for biotechnology - NCBI - information مقایسه شد و نشان داد که این قطعه با توالی هاي مربوط به M. cannonballus موجود در این پایگاه اطلاعاتی 96 در صد همسانی دارد . شناسایی و تشخیص بیماریهاي گیاهی با استفاده از روشهاي مبتنی بر اسیدهاي نوکلئیک، هنوز در مراحل ابتدایی خود می باشد.
کاربرد روز افزون روشهاي مولکولی سبب پذیرش همگانی آن شده بطوریکه امروزه سعی بر آن است که فواید این روشهاي نوین از محیط آزمایشگاه به مزرعه منتقل گردد. شناسایی بیمارگرها با کمک روشهاي مبتنی بر اسید نوکلئیک مزیت عمده بر سایر روشهاي مشابه دارند . - 6 - پروپاگول ها - ذرات ویروس، اسپورها، میسلیوم و ..... - حاوي اسید نوکلئیک کامل هستند. با تغییر شرایط محیطی یا میزبان، توالی اسید نوکلئیک تغییر نمی کند. علاوه بر این توانایی واکنش زنجیره اي پلیمراز در تشخیص یک ملکول از یک توالی خاص به اندازه اي است که قادر می باشد حتی یک سلول زنده بیمارگر را تشخیص دهد. با وجود حساسیت بالاي این روش در شناسایی بیمارگر نیاز به استفاده از محیط کشت جهت شناسایی بیمارگر نیست. این تحقیق استفاده از مارکرهاي ملکولی در تشخیص سریع قارچ ها و در نتیجه کنترل بیماري ناشی از آنها را بسیار کار آمد معرفی کرد.
