بخشی از مقاله
چکیده:
یکی از راههاي مؤثر جهت کنترل علفهاي هرز گیاهان زراعی، کنترل شیمیایی آنها میباشد، که در این بین استفاده از علف کشهاي وسیعالطیف مانند گلایفوسیت که اثرات سوء براي انسان و محیط زیست نداشته باشند در اولویت میباشند. مشکل اصلی این علفکش، حساسیت اکثر گیاهان زراعی به آن میباشد، براي حل این مشکل، شناسایی ژن مقاومت به گلایفوسیت - - aroA و انتقال آن به گیاهان زراعی و تولید گیاهان مقاوم، از اهمیت بسزایی برخوردار است. در این تحقیق جداسازي قسمتی از این ژن از گیاه نی از طریق طراحی پرایمر ویژه از نواحی حفاظت شده در دو طرف این قسمت و واکنش PCR انجام گردید. سپس این ناحیه در پلاسمید pTZ از طریق روش T/A Cloning، همسانهسازي شد. آنالیزهاي مولکولی لازم جهت اثبات حضور ژن در پلاسمید و در نهایت تعیین توالی انجام شد. توالی بدست آمده با سایر توالیهاي شناسایی شده در گیاهان مختلف تطابق داده شد. نتایج این تطابق شباهت قابل توجهی را بین این توالی در گیاه نی با توالی گیاهان Zea mays, Oriza sativa, Triticum aestivum, Zoysia japonica نشان میدهد.
کلمات کلیدي:نی، گلایفوسیت، aroA، همسانهسازي، تعیین توالی
مقدمه:
اکثر گیاهان زراعی داراي علفهاي هرز متعددي بوده که کنترل مکانیکی آنها به سختی صورت میگیرد، و بر این اساس کنترل شیمیایی، یعنی استفاده از علفکشها، بیشتر رایج میباشد. امروزه سعی بر آن است که از علفکشی استفاده گردد که به جزء گیاه زراعی مورد نظر، تمام گیاهان ناخواسته را از بین برده، در خاك ناپایدار باشد و براي سلامتی انسان، دام ومحیط زیست نیز مشکلی ایجاد نکند.گلایفوسیت با نام تجاري رانداپ، علفکش وسیعالطیفی است که ویژگیهاي فوق را داراست به جزء اینکه تمامی گیاهان اعم از علفهرز و گونههاي کشاورزي را از بین میبرد - براون،. - 1386 در سال 1970، گلایفوسیت به عنوان یک علفکش وسیعالطیف عمومی ارائه شد این علفکش ممانعت کننده آنزیم 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphosynthase - EPSPS - میباشد.
این آنزیم واکنش Shikimate-3-phosphate و phosphoenolpyruvateرا کاتالیز میکند که حاصل آن EPSPS و Pi میباشد - کهریزي،. - Padgette, 1991; 1384 این مسیر تنها در گیاهان و تعدادي از میکروارگانیسمها وجود دارد و در انسان و سایر پستانداران و پرندگان مشاهده نشده است، بنابراین رانداپ براي انسان و دام سمیت ندارد - کهریزي،. - Green,2009 ; 1384 در سال 1987، Gasser و همکاران موفق به جداسازي و تعیین توالی کلونهاي cDNA کدکننده EPSPS از پتونیا و گوجهفرنگی شدند - . - Gasser, 1987
بر این مبنا، یافتن گیاهان مقاوم به این علفکش و شناسایی دقیق ژن مقاومت به گلایفوسیت و انتقال آن به گیاهان حساس زراعی جهت ایجاد ارقام مقاوم بسیار با ارزش میباشد و توسعه این ارقام راهکار مؤثري براي کاهش معضلات کنترل علفهاي هرز است. با توجه به گزارشات موجود به نظر میرسد که گیاه نی در مقایسه با سایر گیاهان نسبت به گلایفوسیت مقاومتر می باشد بر این اساس و براي نیل به این هدف، این تحقیق در قالب یک طرح پژوهشی و بر اساس جداکردن قسمتی از این ژن از گیاه نی، کلونسازي و تعیین توالی آن وسپس مقایسه این توالی با توالیهاي موجود در سایر موجودات بویژه گیاهان زراعی در بانک ژن انجام گردید.
مواد و روشها:
مواد گیاهی، سویههاي باکتري و پلاسمید مورد استفاده:
ژنوتیپ مورد استفاده از گیاه نی که از اطراف رودخانههاي کرمانشاه تهیه گردیده بود، استفاده شد که برگها تا زمان استفاده در -70 درجه سانتیگراد نگهداري شدند. سویه باکتري E.coli مورد استفاده DH5α بود. در این تحقیق از پلاسمید PTZ موجود در کیت T/Acloning استفاده گردید.
خالصسازي DNA ژنومیک گیاهی و پلاسمید باکتري:
DNA ژنومی گیاه نی از روش CTAB اسخراج گردید - . - Murray and Thompson, 1980 پلاسمید باکتري نیز از طریق روش Mini-preparation تهیه گردید - . - Sambrook, 2001
طراحی پرایمر و انجام عمل :PCR
براي جداسازي ژن مورد نظر، از روش PCR و یک جفت پرایمر رفتی - - TKZF و برگشتی - - TKZR2 که با مقایسه توالیهاي حفاظت شده گیاهان مختلف بویژه همخانوادههاي نی - گرامینه - و با استفاده از نرمافزارهاي مختلف از جمله DNAstar و Oligo طراحی شدند، استفاده گردید.بعد از واکنش PCR و ران کردن روي ژل آگارز، بر خلاف انتظار به جاي تشکیل تک باند، دو باند با فاصله بسیار نزدیک مشاهده گردید که حتی با انجام چندین واکنش PCR با مقادیر و دماهاي مختلف دیده شدند. این دو باند از هم جدا شده و بازیافت گردیدند و هر کدام جداگانه PCR شد.
همسانهسازي:
قطعه ژن تکثیر شده، به روش T/A cloning در پلاسمید pTZ کلون گردید و سپس این پلاسمیدهاي نوترکیب به باکتري E. coli سویه DH5α منتقل و باکتري حامل پلاسمید نوترکیب بر روي محیط LBA/X-GAL/IPTG که محیطی گزینشگر است منتقل گردیدند. کلونهاي سفید در محیط LB مایع کشت داده شدند و پس از رشد پلاسمید آنها استخراج گردید و جهت اثبات حضور ژن در پلاسمید آزمون پرش و واکنش PCR با پرایمرهاي اختصاصی انجام شد. جهت تأیید نهایی، تعیین توالی ژن انجام گردید.
نتایج و بحث:
نتیجه خالص سازي DNA ژنومی غلظت مناسبی از DNA را نشان داد. نتیجه واکنش PCR با آنزیم DFS- Taq DNA Polymerase در شکل 1 قابل مشاهده است. به طوریکه وجود دو باند نزدیک هم در محدوده 1500bp در شکل قابل مشاهده است. به همین منظور بازیافت و همسانهسازي هر کدام جداگانه انجام شد. در پژوهش حاضر قطعه سبکتر مورد آنالیز قرار گرفت. تأیید اولیه کلونهاي مثبت از طریق آزمون پرش و PCR که در شکل 2و 3 قابل مشاهدهاند و تأیید نهایی توسط توالییابی ژن - به روش ختم زنجیره سنگر - انجام شد که قسمتی از گراف مربوط به آن در شکل شماره 4 ارائه شده است. نتایج تطابق این قطعه در بانک ژن نشان داد که این توالی با توالیهاي با کد AF413081.1 - Oriza sativa - GU256771.1 - Zoysia japonica - ,X63374.1 - Zea mays - ,EU977181. 1 - Triticum aestivum - داراي تشابه قابل توجهی میباشد. نتیجه تطابق با کمک نرمافزار DNAstar نیز شباهت قابل توجهی را نشان میدهد که با مقایسات دقیقتر در قسمتی از توالیها این نتایج بدست آمد:
توالی گیاه نی از ابتداي پرایمرForward با نوکلئوتید شماره 218 درZoysia japonica ، 498 درOriza sativa ، 543 درTriticum aestivum ، 285 در Zea mays تا آخر پرایمرReverse 2 مطابقت دارد، این توالیها در مناطقی با یکدیگر تفاوتهایی دارند.نوکلئوتید 510 در برنج سیتوزین و در نی تیمین، 552 گندم تیمین و در نی گوانین، 577 گندم سیتوزین و در نی تیمین، 582 گندم گوانین ودر نی آدنین، 592،591، 593، 594 گندم بهترتیب آنین، گوانین، تیمین، آدنین و در گندم گوانین، آدنین، سیتوزین، تیمین، 528 برنج آدنین و در نی گوانین، 266 درZoysia japonica آدنین و در نی گوانین می باشد. بر این اساس درخت فیلوژنتیکی - شکل شماره - 6 و فاصله ژنتیکی - شکل شماره - 7 بین این قسمت از توالیهاي موردمطالعه رسم گردید. براین مبنا بیشترین شباهت را گیاه نی با برنج و کمترین شباهت را با گندم دارد. مطالعات بیشتر این توالی ها و نیز جداسازي کامل این ژن در دست اقدام است.
