بخشی از مقاله
چکیده
یکی از مهمترین مشکلات تولید طالبی در ایران، بیماري پژمردگی آوندي استکه عامل آن قارچ Fusarium oxysporum f.sp. melonis race 1 میباشد. تک ژن غالب Fom-2 باعث ایجاد مقاومت در برابر نژاد صفر و یک میشود. در این پژوهش DNA ژنومی ژنوتیپ ایزابل که مقاوم به این بیماري میباشد استخراج شد. به منظور انجام واکنش زنجیره اي پلیمراز، یک جفت آغازگر بر اساس توالی ژن Fom-2 بازیابی شده از بانک اطلاعات NCBI و با استفاده از نرم افزار Primer-3 طراحی گردید. در الگوي الکتروفورز محصول PCR تک باندي به اندازه مورد انتظار 1300 - جفت باز - مشاهده شد. قعطه تکثیرشده در ناقلpGEM-T Easy همسانه سازي شد و به باکتري E-Coli سویه DH5α منتقل گردید. کلونی هاي نوترکیب پس از رشد در محیط کشت انتخابی LB/AMP/X-Gal، گزینش شدند و در محیط کشت LB مایع تکثیر یافتند. بمنظور تأیید نهایی کلونینگ، از تعدادي از کلونی هاي نوترکیب، استخراج پلاسمید و برش با آنزیم برشی EcoR صورت گرفت و با مشاهده الگوي باندي، حضور ژن در ناقل، مورد تأیید قرار گرفت. باکتري هاي داراي ناقل نوترکیب که درون محیط کشت LB مایع تکثیر یافته بودند، جهت انجام مطالعات بعدي از قبیل توالی یابی ژن و طراحی نشانگر براي شناسایی گیاهان حساسو مقاومذخیره گردیدند.
کلمات کلیدي: کلیدي: طالبی، پژمردگی آوندي، ژن مقاومت، همسانه سازي
مقدمه
طالبی - . - Cucumis melo L گیاهی متعلق به خانواده کدوئیان - Cucurbitaceae - و گروه Cantalupensis است. طبق آمار FAO در سال 2012، سطح زیر کشت خربزه و طالبی در ایران حدود 82 هزار هکتار بوده است. یکی از جدي ترین مشکلات در تولید طالبی پژمردگی آوندي است که عامل ایجاد کننده آن قارچ خاکزي Fusarium oxysporum f.sp. melonis - Fom - میباشد . - Oumouloud et al., 2013 - این بیماري باعث زردي، کوتولگی، پژمردگی و در نهایت مرگ گیاه میشود - Madadkhah et al., . - 2012 بر اساس بیماریزایی روي سه رقم افتراقی این قارچ به چهار نژاد 0، 1، 2 و 1/2 طبقه بندي شده است - Oumouloud et al., . - 2013 نژاد 1 از نظر اقتصادي ضررهاي زیادي در کشور ایران وارد میکند . - Madadkhah et al., 2012 -
استفاده از ژنهاي مقاومت در طالبی مؤثرترین روش ایجاد مقاومت در برابر پژمردگی آوندي میباشد. تک ژن غالب Fom-2 باعث ایجاد مقاومت در برابر نژاد 0 و 1 میشود . - Oumouloud et al., 2013 - ژنوتیپ ایزابل به علت دارا بودن این ژن بصورت غالب، توان مقابله با بیماري قارچی فواریوم را دارد و مقاوم به این بیماري میباشد . - Herman and Perl- Treves, 2007 - دستیابی به توالی ژنهاي مقاومت در تولید ارقام مقاوم اهمیت بسیار زیادي دارد. در این تحقیق از ژنوتیپ ایزابل DNA استخراج شد و به عنوان الگو در تکثیر PCR مورد استفاده قرار گرفت. ژن Fom-2 در ناقل pGEM-T Easy کلون شد و به باکتري E-Coli سویه DH5α منتقل گردید. هدف از این پژوهش جداسازي ژن Fom-2 از ژنوتیپ ایزابل و همسانه سازي آن در باکتري E-Coli، جهت انجام مطالعات بعدي از قبیل توالی یابی ژن و طراحی نشانگر براي شناسایی گیاهان حساس و مقاوم بود.
مواد و روشها
بذور ژنوتیپ ایزابل که از مرکز تحقیقات ورامین تهیه شده بود در گلخانه پردیس ابوریحان در نور مصنوعی، شرایط دمایی 22 درجه سانتیگراد، فتوپریود 16 ساعت روشنایی و با رطوبت مناسب کشت شدند. از برگهاي تازه رشد یافته همه گیاهان نمونه برداري صورت گرفت و این نمونه ها براي استخراج DNA مورد استفاده قرار گرفتند. استخراج DNA به روش CTAB انجام شد وکمیت و کیفیت آن با اسپکتوفتومتر طول موج 260 و 280 نانومتر و الکتروفورز بر روي ژل آگارز %1 ارزیابی و تأیید گردید. براي واکنش تکثیر ژن Fom-2، یک جفت آغازگر بر اساس توالی ژن Fom-2 بازیابی شده از بانک اطلاعات NCBI و با استفاده از نرم افزار Primer-3 طراحی گردید - جدول . - 1 هر واکنش زنجیره اي پلیمراز - - PCR حاوي 23 میکرولیتر از Taq DNA Polymerase Mix Red با غلظت1/5 میکرومولار Mgcl2 ، یک میکرولیتر از هر آغازگر با غلظت 10 میکرومولار و یک میکرولیتر از DNA ژنومی بود.
واکنش PCR مطابق جدول 2 و با 35 چرخه انجام گرفت. پنج میکرولیتر از محصول روي ژل آگارز 1 درصد الکتروفورز گردید. باند موردنظر از روي ژل برش داده شد و به کمک کیت - Bioneer - AccuPrep تخلیص ژن از باند صورت گرفت. قطعه ژن خالص شده ي موردنظر درون ناقل - Promega Corporation, Madison, WI, USA - pGEM-T Easy همسانه سازي شد. طبق پروتکل شرکت سازنده، پلاسمیدها به باکتري E-Coli - سویه - DH5α انتقال داده شدند. براي تشخیص باکتري هاي نوترکیب از غیرنوترکیب از محیط کشت LB/AMP/X-Gal استفاده شد. کلونی هاي سفید انتخاب و براي رشد و تکثیر در محیط کشت LB مایع مایه زنی شد. فالکونهاي حاوي محیط کشت LB مایع و باکتري، درون انکوباتور - دماي 37 درجه سانتیگراد و دور - 1800 rpm بصورت کشت شبانه قرار داده شدند. روز بعد باکتري ها جهت نگهداري و ذخیره با نسبت 1:1 با گلیسرول مخلوط شده و در دماي -20 درجه سانتیگراد قرار گرفتند.
