بخشی از مقاله
خلاصه
Artemisia annua از گیاهان بومی مناطق ﴰال ایران می باشد،که داراي ترکیبات ضد مالاریایی سسکوئی ترپن آندوپرکسید، آرﲤیزینﲔ می باشد، آمورفا 4،11 داین یکی از ترکیبات واسطه در فرایند زﳒﲑه اي تولید آرﲤیزینﲔ می باشد، که از تبدیل فارنسیل دي فسفات توسط آنزﱘ سسکوئی ترپن سیکلاز تولید می شود.براي اولﲔ بار در کشور در زمینه افزایش میزان متابولیت هاي ثانویه در گیاهان داروئی اقدام شود، بنابراین cDNA مربوط به این ژن توسط پراﳝرهاي اختصاصی از mRNA هاي گیاه فوق ساخته شد، که شامل 1734 جفت باز و 577 اسید آمینه می باشد.تواﱄ فوق به ترتیب در ناقلﲔ pSK ، pBI121 جهت تواﱄ سنجی و بیان در گیاه ﳘسانه سازي گردید. نتایج تواﱄ یابی حاکی از آن است، که ژن SQC جدا شده از واریته بومی ایران داراي %99.7 مشاﲠت با یافته پیشﲔ در این زمینه می باشد. براي ارزیابی میزان تاثﲑ این ژن در گیاه، در جهت تولید مادۀ موثرۀ آرﲤیزینﲔ نسبت به گیاه شاهد، از روش بیان موقت به وسیله آگرواینفیلﱰاسیون استفاده شد. نتایج روشنگر آن است که، ﳕونه گیاهان ترارﳜت شده، نسبت به شاهد %29 افزایش آرﲤیزینﲔ را دارا می باشد.
-1 مقدمه
Artemisia annua یا درمنه خزري با نام ﳏلی گندواش، منبع آرﲤیزینﲔ - Qinghaosu - می باشد، که فعالیت موثر بر علیه انواع نژاد مالاریا دارد.[2 ,1] مکانیسم عمل آرﲤیزینﲔ در باند پراکسیدي و تولید رادیکال هاي آزاد در واکنش با هِم می باشد.[3] به علت افزایش مقاومت بیماري، آرﲤیزینﲔ می تواند گزینه مناسﱯ باشد. با توجه به مرگ و مﲑ بالا در دنیا، میزان پائﲔ آرﲤیزینﲔ - %0.01 تا [4] - %0.5 و عدم سنتز مصنوعی آن، مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژي می تواند گزینه مطلوبی جهت افزایش آن ﳏسوب گردد. براي ساخت آرﲤیزینﲔ آنزﱘ سسکوئی ترپن سیکلاز - - SQC، آمورفا 4،11 داین را تولید می ﳕاید. ژن مربوطه از A.annua بومی ایران جدا گردد. بر این اساس آغازگرهاي اختصاصی براي ابتدا و انتهاي ژن طراحی شد. با ساخت cDNA، تکثﲑ، ﳘسانه سازي، تواﱄ یابی،انتقال به ناقل دوتایی و انتقال موقت اﳒام شد.
-2 مواد و روش ها
1-2 مواد گیاهی و کشت بذور
بذور گیاه مورد نظر از ایران، گیلان، رشت ﲨع آوري گردید، پس از اسﱰیلازیسیون، در ﳏیط MS کشت گردیدند.[5]
2-2 استخراج RNA و ساخت cDNA
ابتدا اندام هاي هوایی به خوبی خرد گردیده، سپس از کیت استخراج RNA XPLUS استفاده گردید .براي ساخت cDNA از RNA حاصل با آغازگر oligo dT، آنزﱘ MMULV و dNTP استفاده گردید.PCR 3-2در مواد اولیه PCR از cDNA ساخته شده به عنوان الگو، بافر 10X، MgCl2، dNTP، آغازگر ابتدائی، آغازگر انتهائی و آنزﱘ PFU استفاده شد. بدین ترتیب که، دماي 94oC اولیه، 5 دقیقه، 35 چرخه به صورت، 1 دقیقه 94oC ، 1 دقیقه 57oC و 1 دقیقه 72oC، در انتها 10 دقیقه براي بسط هنایی در 72oC استفاده شد.
4-2 ﳘسانه سازي و ارزیابی
قطعات حاصل از PCR خالص سازي و در ناقل pSK در Escherichia coli ﳘسانه سازي شد.براي تائید ورود قطعه به داخل ناقل PCR و هضم برشی اﳒام شد.در هنایت قطعه مذکور مورد تواﱄ یابی قرار گرفت. قطعه ﳘسانه سازي شده در ناقل فوق، در ناقل pBI121 در E.coli ﳘسانه سازي گردید و مورد تائید قرار گرفت. در هنایت پلاﲰید حاوي ژن SQC به Agrobacterium tumefaciens سویه GV3850 منتقل شد.
5-2 انتقال موقت
ابتدا لاین A.tumefaciens داراي پلاﲰید نو ترکیب، کشت شبانه داده شد.باکﱰي ها رسوب داده شده، در ﳏیط القائی کشت داده شد. ریز گیاهان برگی درون آن وارد شده، توسط سیستم فیلﱰاسیون خلأ، خلأ اعمال شد. به سرعت خلأ از میان رفته، ﳕونه ها به مدت 5-4 روز در پﱰي قرار داده شد.
6-2 آنالیز HPLC بر روي ریز گیاهان انتقال موقت
ریزگیاهان دماي 60oC به مدت 48 ساعت خشک گردیدند.سپس از آهنا عصاره گﲑي اﳒام شد .از دستگاه Varian prostar مدل 410 ستون 3.9×30 mm C18 wat 011695 براي HPLC استفاده شد. فاز متحرک استفاده شده شامل، Po4rNa2Po4H2Na %60 و %40 متانول با فشار 0.45 و مدت زمان 20 دقیقه بود. طول موج شناسایی آرﲤیزینﲔ 206 nm بود.براي سنجش آرﲤیزینﲔ از استاندارد با خلوص %98 شرکت آلدریک سیگما استفاده شد.
-3 نتایج و ﲝث
1-3ﳘسانه سازي ژن SQC ایران
تواﱄ cDNA جدا شده شامل 1734 نوکلئوتید است، که داراي مشاﲠت %99.7 با ژن پیشﲔ می باشد .[6]قبلاً از ﳘسانه سازي SQC و عمل آن در E.coli گزارشی ارائه شده، در مطالعه پیشﲔ، تنها شناسایی ژن هاي دخیل در سنتز آرﲤیزینﲔ و تولید در باکﱰي اﳒام شده است.[6] مطالعه اي نیز بر روي انتقال ژن FDS از گیاه پنبه به A.annua صورت گرفته، که حاکی از 2 تا 3 برابر شدن آرﲤیزینﲔ در گیاه ترارﳜت است.[7]تا آﳒا که اطلاع حاصل شده است، هیچ گونه گزارشی از ﳘسانه سازي این ژن، در ناقل دوتایی براي انتقال به گیاه اﳒام نشده است - شکل. - 1-3
2-3 مقایسه ژن SQC با تواﱄ هاي پیشﲔ
پس از تعیﲔ تواﱄ ژن مذکور، با یافته پیشﲔ، به ترتیب در نوکلئوتیدهاي 120 باز C با T،181 باز A با G ،696 باز T با A،749 باز A با T، 1083 باز G با A در توده ایرانی جا به جا شده است.بر این اساس مقایسه تواﱄ اسید آمینه، بدین صورت که، اسید آمینه 61 فنیل آلانﲔ با کد F، جایگزین اسید آمینه لوسﲔ با کد L گردیده، اسید آمینه 250 والﲔ با کد V ، جایگزین اسید آمینه آسپاراتیک اسید با کد D گردیده و ﳘچنﲔ اسید آمینه 361 ایزولوسﲔ با کد I جایگزین متیونﲔ با کد M گردیده است.
3-3 انتقال موقت، بیان ﳎدد و HPLC
در دنیا هیچگونه گزارشی مبﲏ بر انتقال موقت ژن SQC اﳒام نشده است، که می تواند راه حلی سریع، در جهت تولید و افزایش آرﲤیزینﲔ باشد.3 تا 5 روز پس از فیلﱰاسیون خلأ ﳕونه ها طبق مطالعاتی که توسط ﳏققﲔ براي شناسایی آرﲤیزینﲔ اﳒام شده است، توسط HPLC مورد ارزیابی قرار گرفت.[9-8] ﳘانطورکه مشخص شده است، ژن SQC به مقدار %29 باعث افزایش میزان آرﲤیزینﲔ شده است. این افزایش خود نشان از اثر بالاي ژن SQC در سنتز آرﲤیزینﲔ می باشد.با این حال مطالعات ﳘچنان بر روي گیاهان ترارﳜت که انتقال دائم در آهنا اﳒام شده است، ادامه دارد.
