بخشی از مقاله
چکیده
ویروس موزاییک زرد جو یکی از مهم ترین عوامل خسارت زا در مزارع جو محسوب می شود. به منظور تشخیص و ردیابی این ویروس در استان یزد، طی سال هاي 1393 الی 94 از مزارع جو مناطق مختلف استان شامل تفت، یزد، میبد و دهنو با علایم مشکوك به بیماري از جمله موزاییک، زردي و کوتولگی، بازدید و نمونه برداري به عمل آمد. نمونههاي جمعآوري شده با انجام آزمون الایزا و استفاده از آنتی-بادي چند همسانه اي ویروس موزاییک زرد جو و همچنین واکنش زنجیرهاي پلی مراز - PCR - تک مرحلهاي و دو مرحلهاي با استفاده از جفت آغازگرهاي - Bay-F, Bay-R - و - Bans-F, Bans-R - طراحی شده از توالی پروتئین پوششی و NIb مورد بررسی قرار گرفتند.
بر اساس نتایج به دست آمده از آزمون دو الایزا از 86 نمونه ي جمع آوري شده، 18/6 درصد به ویروس موزاییک زرد جو آلوده بودند. واکنش زنجیرهاي پلیمراز تک مرحلهاي و دو مرحلهاي با استفاده از جفت آغازگرهاي اختصاصی ذکر شده بر روي نمونه هاي مثبت در آزمون الایزا به ترتیب قطعات 960 و 420 جفت بازي را تکثیر نمود. همچنین با رنگ آمیزي و بررسی میکروسکوپی ریشههاي بوتههاي آلوده به ویروس، اسپورهاي استراحتی قارچ Polymyxa graminis که به عنوان ناقل این ویروس معرفی شده است، تشخیص داده شد.
مقدمه
غلات، نقش ویژه و مهمی در الگوي مصرف هر کشوري دارند و یکی از مهمترین تولیدات غذایی براي انسان میباشند. تقریباً 55 درصد از پروتئینها و به طور کلی 50 تا 55 درصد کالري مصرف شده توسط انسان در دنیا به وسیلهي غلات تأمین می گردد. از این بین، گندم و جو بیشترین سطح کشت را دارند. گروه وسیعی از ویروسهاي گیاهی غلات را آلوده کرده و موجب خسارتهاي اقتصادي فراوانی میشوند. از جمله این ویروسها میتوان به ویروسهاي خاك زاد غلات که به طور کلی به دو جنس Furovirus و Bymovirus تعلق دارند، اشاره کرد
ویروس موزاییک زرد جو1، گونهي تیپ جنس Bymovirus، پیکرههاي رشتهاي خمشپذیر دارند. ژنوم آنها دو بخشی است و به صورت آر.ان.اي2 تک رشتهاي مثبت است. این ویروس که براي اولین بار در سال 1940 از ژاپن گزارش شده، امروزه به عنوان یکی از بیمارگرهاي مهم مزارع جو در آسیا و کشورهاي اروپایی مانند آلمان و فرانسه محسوب میشود و توسط قارچ Polymyxa graminis منتقل می شود
در سال 1989 ژن پروتئین پوششی این ویروس تعیین توالی و توالی نوکلئوتیدي آن با توالی پروتئین پوششی برخی از پوتیویروسها مقایسه شد. مقایسهي توالیها نشان داد که شباهت کمی بین ویروس موزاییک زرد جو و سایر پوتیویروسها از لحاظ پروتئین پوششی وجود دارد
در مطالعه اي در آلمان، ارقامی از گیاه جو که به ویروس موزاییک زرد جو مقاوم بودند مورد بررسی قرار گرفتند و نتایج نشان داد که ژن مقاومت به این ویروس در ژنوم گیاه، روي کروموزوم شمارهي 3 قرار دارد
چن و همکاران، توالی نوکلئوتیدي جدایهاي از ویروس از چین را به طور کامل، تعیین کردند. بررسیهاي فیلوژنتیکی بین جدایههاي آسیایی و اروپایی این ویروس، نشان داد که جدایههاي آسیایی و اروپایی، دو گروه مجزا از هم را تشکیل میدهند
در ایران، در مطالعه اي که حسینی و همکاران انجام دادند، ویروس موزاییک زرد جو را از چهار استان خراسان رضوي،خراسان جنوبی، آذربایجان غربی و گلستان گزارش کردند. نتایج آنالیزهاي فیلوژنتیکی بر اساس توالی پروتئین
پوششی نشان داد که جدایه هاي ایرانی این ویروس در مقایسه با جدایه هاي آسیایی، شباهت بیشتري به جدایه هاي اروپایی دارند
با توجه به این که به طور کلی اطلاعات چندانی از ویروس هاي خاك زاد غلات در ایران وجود ندارد، این مطالعه
به منظور جمع آوري اطلاعات از وضعیت ویروس موزاییک زرد جو در مزارع جو استان یزد صورت گرفت.
مواد و روش ها
به منظور تشخیص و ردیابی ویروس موزاییک زرد جو طی سال هاي 1393-94 از برخی مزارع جو استان یزد با علایم مشکوك به بیماري از جمله زردي، موزاییک و کوتولگی، بازدید و نمونه برداري صورت گرفت. آلودگی اولیهي نمونه ها به ویروس توسط آزمون ساندویچ دو طرفه الایزا1به روش کلارك و آدامز - 2 - به کمک آنتی بادي هاي چند همسانه اي ویروس موزاییک زرد جو مورد بررسی قرار گرفت.
جهت تشخیص مولکولی نمونه هاي آلوده به ویروس از واکنش زنجیره اي پلی- مراز2 به صورت تک مرحله اي و دو مرحله اي استفاده شد. از هم ردیف سازي چندگانه توالی هاي مربوط به ژنوم ویروس موجود در بانک جهانی ژن، بر اساس ناحیه هاي ژنی مشابه در بین جدایه هاي مختلف جهان، آغازگرهاي اختصاصی به منظور تکثیر منطقه ژنی رمزکننده پروتئین پوششی و انتهاي پروتئین NIb به کمک نرم افزار Fast PCR طراحی شد. جفت آغازگر - Bay-F, Bay-R - به عنوان آغازگرهاي خارجی و جهت تکثیر قطعه بزرگ تر در مرحله اول PCR و جفت آغازگر - Bans-F, Bans-R - به عنوان آغازگرهاي داخلی و تکثیر کننده قطعه کوچکتر در مرحله دوم واکنش PCR در نظر گرفته شدند.
محصول واکنش PCR مرحله اول به کمک رنگ آمیزي بر روي ژل آگارز 1 درصد و انجام الکتروفورز و عکسبرداري توسط اشعه ماوراي بنفش مورد بررسی قرار گرفت. نمونه هاي آزمون شده در مرحله اول به کمک آب مقطر استریل دو بار تقطیر به نسبت 1 به 100 رقیق شد و به عنوان الگو جهت انجام مرحله دوم واکنش PCR مورد استفاده قرار گرفت. صحت وجود قطعات تکثیر شده مورد نظر در مرحله دوم نیز به کمک الکتروفورز بر روي ژل آگارز تایید شد. با توجه به این که قارچ Polymyxa graminis به عنوان ناقل ویروس شناخته شده است، ریشه هاي بوته هاي آلوده براي تایید وجود این قارچ به کمک رنگ آمیزي با محلول لاکتوفنل – اسید فوکسین3و مشاهده آن ها در زیر میکروسکوپ نوري بررسی شدند.
نتایج و بحث
این مطالعه طی دو سال به منظور تشخیص و ردیابی ویروس موزاییک زرد جو در مزارع جو استان یزد انجام شد. در مناطق نمونه برداري، علایم زردي، موزاییک و کوتولگی روي بوته ها مشاهده شد - شکل . - 1 آزمون هاي سرولوژیکی و مولکولی براي تشخیص و همچنین تعیین برخی از خصوصیات این ویروس مورد استفاده قرار گرفت. بر اساس نتایج به دست آمده از آزمون ساندویچ دو طرفه الایزا به کمک آنتی بادي اختصاصی علیه ویروس، 18/6 درصد از نمونه هاي جمع آوري شده به ویروس موزاییک زرد جو آلوده بودند
شکل -1 علایم زردي، موزاییک و کوتولگی روي بوته هاي آلوده به ویروس موزاییک زرد جو
جدول :1 نتایج آزمون الایزا روي نمونه هاي جو جمع آوري شده از نواحی مختلف استان یزد
به منظور تعیین خصوصیات ویروس موزاییک زرد جو، از نمونه هاي مثبت در آزمون الایزا در واکنش زنجیره اي پلی مراز به صورت تک مرحله اي و دو مرحله اي به کمک آغازگرهاي اختصاصی طراحی شده از روي توالی هاي مربوط به ویروس موجود در بانک جهانی ژن استفاده شد. جفت آغازگرهاي - Bay-F, Bay-R - در مرحله اول، قطعه مورد نظر 960 جفت بازي را از نمونه هاي آلوده به ویروس تکثیر نمود - شکل-2الف - . نمونه هاي آزمون شده که در واکنش مرحله اول پس از رقیق سازي به عنوان الگو در مرحله دوم استفاده شدند به کمک جفت آغازگرهاي - Bans-F, Bans-R - ، قطعه 420 جفت بازي مورد نظر را تکثیر کردند
شکل -2 نتایج الکتروفورز قطعات حاصل از واکنش PCR درون ژل آگارز 1 درصد. - الف - قظعه 960 جفت بازي تکثیر شده با جفت آغازگرهاي . - Bay-F, Bay-R - - ب - قطعه 420 جفت بازي تکثیر شده توسط جفت آغازگر :M . - Bans-F, Bans- R - نشانگر دي. ان. اي . - 100bp - راهکهاي 1 تا :3 نمونه هاي آلوده به ویروس موزاییک زرد جو. راهک:4 عصاره گیاه جو سالم به عنوان کنترل منفی
