بخشی از مقاله
چکیده:
ویروس موزائیک آرابیس - Arabis mosaic virus-ArMV - از جمله ویروسهاي مهم بیمارگر در گیاهان محسوب میگردد. این ویروس با پیکرههاي ایزومتریک بقطر 25 تا 27 نانومتر عضو جنس Nepovirus از خانواده Comoviridae میباشد. در سالهاي 1388 و 1389 تعداد 39 نمونه مو - Vitis vinifera - با علائم بدشکلی و زردي برگها، کاهش رشد همراه با کاهش تعداد و غیریکنواختی اندازه حبههاي خوشهها، در تعدادي از باغات استانهاي هرمزگان و سیستان و بلوچستان مشاهده و جمعآوري گردید. این نمونهها با استفاده از آنتیبادیهاي اختصاصی علیه هشت ویروس مهم بیمارگر در مو به روش DAS-ELISA مورد آزمون قرار گرفتند. تعداد 21 نمونه با آنتیبادي اختصاصی ویروس ArMV داراي واکنش مثبت بودند در حالیکه سایر نمونه ها و نیز شاهد سالم فاقد واکنش مثبت بودند. نمونههایی که داراي واکنش مثبت بودند روي گیاهان آزمون Chenopodium quinoa، Ch. amaranticolor و Cucumis sativus مایهزنی مکانیکی شدند.
همچنین آر.ان.اي کل مربوط به 39 نمونه مورد بررسی استخراج شده و حضور ArMV در آنها با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی و بکمک واکنش زنجیرهاي پلیمراز مورد بررسی قرار گرفت. حدود 3 تا 5 روز پس از مایهزنی، علائم لکههاي موضعی و سپس سیستمیک شدن ویروس بشکل سبزردي در هر سه گونه گیاه فوق ظاهر شد. طی واکنش زنجیرهاي پلیمراز، در 33 مورد از 39 نمونه مورد بررسی، قطعهاي باندازه حدود 300 جفت باز ساخته شد که با اندازه مورد انتظار مطابقت داشت. نتایج حاصل از مقایسه توالی نوکلئوتیدي این قطعه با سایر توالیهاي قابل دسترسی در بانک ژن با استفاده از ابزار جستجوي BLAST، نشان داد که این توالی داراي بیشترین مشابهت - بالاي 99 درصد - با توالیهاي ثبت شده در مورد ویروس ArMV میباشد. این اولین گزارش از ردیابی مولکولی این ویروس با استفاده از واکنش زنجیرهاي پلیمراز در تاکستانهاي مناطق جنوب و جنوب شرق کشور میباشد.
کلمات کلیدي: مو، ویروس موزائیک آرابیس، واکنش زنجیرهاي پلیمراز.
مقدمه:
ویروس موزائیک آرابیس - Arabis mosaic virus-ArMV - عضو جنس Nepovirus از خانواده Comoviridae می باشد. این ویروس داراي پیکرههاي ایزومتریک به قطر حدود 25 تا 27 نانومتر است. ژنوم آن متشکل از دو مولکول آر.ان.اي تک رشتهاي بطول 9 و 4/1 کیلوباز میباشد. این ویروس داراي دامنه میزبانی نسبتا وسیعی است و در بیش از 9 خانواده گیاهی میتواند ایجاد آلودگی و بیماري نماید . - 2 - این ویروس توسط چند گونه نماتد خاکزي از طریق ریشه، مایهزنی مکانیکی، قلمه و پیوندزنی و نیز بذر به گیاهان میزبان منتقل می گردد. این ویروس در گیاهان زراعی و باغی و نیز گیاهان غیر زراعی متعددي ایجاد بیماري می نماید. از جمله میزبانهاي مهم این ویروس می توان به درختان میوه، درختچهها و گیاهان زینتی و برخی گیاهان زراعی اشاره نمود. علائم آلودگی معمولا بصورت زردي، کاهش یا توقف رشد و گاهی پیسک در برگها بروز مینماید - 4 و . - 6 در پاییز و زمستان سال 1388 و 1389 تعدادي درختچه مو با علائم بدشکلی و سبزردي برگها و کاهش رشد در باغات استانهاي هرمزگان و نواحی جنوبی سیستان و بلوچستان مشاهده و نمونهبرداري گردید. در این تحقیق، آلودگی این نمونهها به ویروس موزائیک آرابیس با استفاده از روشهاي سرولوژیکی الایزا و نیز روش مولکولی واکنش زنجیرهاي پلیمراز بررسی و تایید گردید. این اولین گزارش از ردیابی مولکولی این ویروس از موکاریهاي جنوب کشور در استانهاي هرمزگان و سیستان و بلوچستان میباشد.
مواد و روشها:
در تابستان سالهاي 1388 و 1389 تعدادي از درختچههاي مو با علائم بدشکلی و سبزردي برگها همراه با کاهش رشد در برخی باغات استانهاي هرمزگان و سیستان و بلوچستان مشاهده گردید. از این بوتهها نمونهبرداري شده و نمونهها در جعبه یونولیتی حاوي یخ به آزمایشگاه منتقل شدند. مجموعا تعداد 39 نمونه برگی علائمدار تهیه شد. نمونه هاي جمعآوري شده از نظر آلودگی به ویروسهاي Arabis mosaic virus-ArMV ، Grapevine fan leaf virus-GFLV ، Grapevine fleck virus-GFkV ، Grapevine leaf roll associated virus 3 - GLRaV3 ، Grapevine leaf roll associated virus 1-GLRaV1 ، Grapevine virus A-GVA ، Raspberry ring spot virus-RRSV ، Tomato ring spot virus-TmRSV به روش سرولوژیکی DAS-ELISA مورد آزمون قرارگرفتند . - 3 - آنتیبادي اختصاصی هر یک از این ویروس ها بهمراه شاهد مثبت و منفی مربوطه از شرکت بیوربا سوئیس تهیه شده و طبق توصیه شرکت سازندة آنها بکار رفتند.
بشقابکهاي الایزا از نوع گرینر - هايباندینگ، ساخت آلمان - بوده و حجم واکنشها 100 میکرولیتر انتخاب شد. نمونههاي برگی در بافر عصارهگیري شامل بافر تریس 0/1 مولار با اسیدیته 8/2 و به نسبت 1 گرم بافت در 10 میلیلیتر بافر، له و عصاره گیري شدند. پس از اتمام آزمون، نتایج واکنشها یک ساعت بعد از افزودن سوبسترا، توسط دستگاه الایزا ریدر مدل مولتی اسکن، ساخت کارخانه لبسیستم فنلاند در طول موج 405 نانومتر مورد خوانش قرار گرفت. نمونههایی که میزان جذب نوري چاهک مربوطه برابر یا بزرگتر از سه برابر میانگین جذب مربوط به شاهد سالم بود، بعنوان نمونههاي با واکنش مثبت - آلوده - در نظر گرفته شدند. نمونههایی که در آزمون الایزا داراي واکنش مثبت بودند پس از عصارهگیري در بافر فسفات 0/1 مولار سرد با اسیدیته 7/4 روي گیاهان محک Chenopodium quinoa، Ch. amaranticolor و Cucumis sativus مایهزنی مکانیکی شدند.
در مرحله بعد آر.ان.اي کل مربوط به تمام 39 نمونه مورد بررسی - حتی نمونه هاي بدون واکنش مثبت در آزمون الایزا - با استفاده از محلول تجاري تري-ریئجنت - سیگما، آمریکا - و طبق روش توصیه شده توسط شرکت سازنده استخراج شد. جهت بررسی کمیت و کیفیت نوکلئیک اسید استخراجی، از روش اسپکتروفتومتري و نیز الکتروفورز در ژل آگارز %1 استفاده شد. بمنظور تکثیر ناحیهاي از ژنوم ویروس - ناحیه ژن پروتئین حرکتی ویروس - ، از روش و آغازگرهاي توصیفی توسط وتزل و همکاران - 2002 - با اندکی تغییرات استفاده شد . - 7 - محصول واکنش زنجیرهاي پلیمراز روي ژل آگارز %1 الکتروفورز شده و پس از رنگآمیزي با اتیدیوم بروماید - یک میکروگرم در میلیلیتر - ، مشاهده گردید. قطعه دي . ان.اي تکثیر یافته طی واکنش زنجیرهاي پلیمراز با استفاده از کیت تجاري استخراج محصول پی.سی.آر ساخت شرکت MN - آلمان - ، استخراج و خالصسازي شده و بطور مستقیم و با استفاده از سرویسهاي تجاري موجود تعیین توالی گردید. عمل خواندن و تعیین توالی قطعه در هر دو جهت و با استفاده از آغازگرها اختصاصی مربوطه انجام گردید. توالی حاصل در مورد جدایه مورد بررسی با استفاده از ابزار جستجوي BLAST موجود در پایگاه اطلاعاتی NCBI با سایر توالیهاي ثبت شده در بانک ژن مورد مقایسه قرار گرفت . - 1 -
نتایج و بحث:
از بین 39 نمونه برگی مو با علائم مشکوك، تعداد 21 مورد با آنتی بادي اختصاصی ویروس ArMV داراي واکنش مثبت بودند. مشخصترین علائم همراه با این نمونهها، سبزردي و کاهش رشد آنها بود. حدود 3 تا 5 روز پس از مایهزنی، علائم لکه هاي موضعی و سپس سیستمیک شدن ویروس بشکل سبزردي در هر سه گونه گیاه مایه زنی شده Chenopodium quinoa، Ch. amaranticolor و Cucumis sativus ظاهر شد که با خصوصیات توصیف شده در مورد ویروس ArMV مطابقت داشت 2 - و . - 6 با استفاده از آغازگرهاي اختصاصی ArMV، طی واکنش زنجیرهاي پلیمراز، در 33 مورد از 39 نمونه مورد بررسی، یک قطعه دي.ان.اي بطول حدود 300 جفت باز تکثیر گردید که با اندازه قطعه مورد انتظار مطابقت داشته - 7 - و در نمونه هاي شاهد سالم چنین قطعهاي مشاهده نشد
. نتایج حاصل از مقایسه توالی نوکلئوتیدي این قطعه با سایر توالیهاي قابل دسترسی در بانک ژن با استفاده از ابزار جستجوي BLAST، نشان داد که این توالی داراي بیشترین مشابهت - بالاي 99 درصد - با توالیهاي ثبت شده در مورد ویروس موزائیک آرابیس میباشد. ویروس موزائیک آرابیس با استفاده از روشهاي سرولوژیکی مانند الایزا قبلا از روي مو و برخی گیاهان زینتی از ایران گزارش شده است - 5 - ولی این اولین گزارش از ردیابی مولکولی این ویروس با استفاده از واکنش زنجیرهاي پلیمراز در تاکستانهاي مناطق جنوب و جنوب شرق کشور میباشد. ویروس ArMV بویژه در صورت همراه بودن با ویروس GFLV میتواند موجب زوال و مرگ تدریجی مو گردد 4 - و . - 6 غلظت این ویروس در بافت برگ مو بویژه در طول تابستان و گرم شدن هوا کاهش محسوسی داشته و براحتی با استفاده از تکنیک الایزا قابل ردیابی نمینمی باشد. از اینرو براي ردیابی این ویروس که یکی از اقدامات اولیه در جهت مدیریت و کاهش خسارت ناشی از آن است، تکنیک مولکولی پی.سی.آر بسیار مناسبتر و قابل اعتمادتر میباشد.
تشکر و قدردانی:
از موسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور که هزینه انجام این پژوهش را تامین کرده است، تشکر میگردد.
