بخشی از مقاله
مقدمه
شناخت و درک صحیح اصول اپیدمیولوژی عوامل باکتریایی پاتوژن در میکروبشناسی پزشکی و دامپزشکی از اهمیت بسیاری برخوردار است. سالمونلا یکی مهمترین عوامل پاتوژن زئونوز باکتریایی منتقل شونده از طریق غذا و یکی از مهمترین مشکلات بهداشتی در سراسر دنیا بشمار میرود. اهمیت این باکتری در ایجاد و بروز عفونتهای دامی و انسانی ضرورت بررسی روشهای مؤثر در جداسازی و تایپینگ این باکتری را گوشزد میکند. روش های مختلفی نظیر بیوتایپینگ، سروتایپینگ، باکتریوفاژ یا باکتریوسین تایپینگ و پروفایل حساسیت پادزیستی جهت تایپینگ و دسته بندی عوامل عفونی نظیر سالمونلاها از گذشته استفاده شده و می شود. اما امروزه بکارگیری روش های مولکولی به دلیل اختصاصیت بیشتر، سرعت بالاتر و قابلیت تکرار پذیری از اهمیت ویژه ای در این زمینه برخوردار شده اند. در این نوشتار سعی شده است بطور مختصر روشهای مولکولی تایپینگ سالمونلاها شرح داده شوند.
کلمات کلیدی: تایپینگ، سالمونلا، اپیدمیولوژی
-1 پلاسمید تایپینگ1
پلاسمید تایپینگ اولین روش ژنوتایپینگ است که جهت تفریق و تمایز سویه های اعضای خانواده آنتروباکتریاسه مورد استفاده قرار کرفته است. اکثر سویه های وحشی سالمونلا واجد پلاسمیدهایی با اندازه 150 - 2 کیلوباز میباشند. این پلاسمیدها را میتوان به آسانی از باکتری استخراج و آنها را بر اساس وزن مولکولی اشان در ژل آگاروز با استفاده از الکتروفورز بعد از رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید تشخیص داد. این روش را که بنام نقشه برداری پلاسمیدی2 خوانده می شود روش بسیار مناسبی برای طبقه بندی و نیز تعیین قرابت سویه های جدا شده از اپیدمی های سالمونلایی میباشد. این روش ارزان، ساده و سریع بوده و حتی در مقایسه با فاژتایپینگ مناسب تر بنظر میرسد 1 - ، 2، . - 10
چنانچه پلاسمیدهای استخراج شده را تحت تأثیر آنزیمهای محدودیت اندونوکلئازی هضم3 کرد حساسیت این روش که نقشه محدودیت - آندونوکلئاز4خوانده می شود افزایش میابد. از آنجا که پلاسمیدهای مشابه دارای الگوهای اندونوکلئازی یکسانی هستند به آسانی میتوان با مقایسه الگوهای پلاسمیدهای سویه های مسبب اپیدمی ها، قرابت سویه های مسبب را در نواحی مختلف مورد ارزیابی قرار داد . - 10 - در مطالعاتی که بر روی 107 سویه سالمونلا تیفی موریوم جدا شده از موارد آنتریت انجام گرفته است نامبرده توانسته 76 سویه دارای پلاسمید را شناسایی و بر اساس نقشه پلاسمیدی آنها را به 36 الگو تقسیم نماید. 39 سویه دیگر را که واجد پلاسمیدهای بزرگتر از 42 کیلوباز بودند نامبرده توانست 17 سویه مقاوم به آنتی بیوتیک ها را شناسایی نماید که در چهار سویه آن انتقال پلاسمید بوسیله جفت گیری انجام شده بود . - 1 -
در بررسی دیگری که مایلمان و همکاران - 1995 - 5 بر روی 56 سویه سالمونلا تیفی موریوم و14 سویه سالمونلا آنتریتیدیس در فرانسه انجام گرفته است، نامبردگان توانستند 8 الگوی پلاسمیدی را در بین 56 سویه سالمونلا تیفی موریوم مشخص سازند. کلیه این سویه ها واجد یک پلاسمید 90 کیلوباز اختصاصی سروتیپ بودند. در مقابل در 14 سویه سالمونلا آنتریتیدیس 2 الگوی پلاسمیدی مشخص گردید که یکی از آنها پلاسمیدی با وزن 54 کیلوباز است که بنظر میرسد اختصاصی سروتیپ باشد . - 9 - هر چند پلاسمید تایپینگ دارای قابلیت های زیادی است اما با این وجود دارای محدودیت هایی نیز میباشد. بدین ترتیب که اغلب نمی توان ارتباط چند سویه را که یک پلاسمید غیر قابل تمایز را با خود حمل می کنند، مشخص نمود . - 1 -
-2 الکتروفورز در میدان تناوبی6
در اغلب اوقات این روش را بعنوان یک روش استاندارد طلایی7 در بین روشهای مولکولی تایپینگ در نظر میگیرند. این روش بر روی DNA ژنومی یا کروموزوم کامل8 انجام میگیرد و قادر است قطعات بلند مولکولی را به اندازه 800-10 کیلوباز تفکیک نماید. در این روش ابتدا باکتریهای تکثیر یافته در محیطهای کشت آزمایشگاهی را با آگار مذاب ترکیب میکنند و سپس آنها را در قالب های کوچکی ریخته و بدین شکل پلاکهای آگاروز واجد باکتری را تحت تأثیر لیز آنزیمی- دترجنتی9 و سپس آنزیم های محدودیت اندونوکلئازی قرار میدهند. باکتریهای هضم شده درون قالب ها را درون یک ژل آگاروز کرده و آنها را در یک دستگاه خاص الکتروفورز که بشکل تناوبی قطبین مثبت و منفی آن به فواصل از پیش تعیین شده تغییر میابد، قرار می دهند. الگوهای الکتروفورتیک قطعات DNA را بعد از رنگ آمیزی با یک رنگ فلوئورسنت نظیر اتیدیوم بروماید مشاهده و عکس برداری می کنند.
نتایج بدست آمده را می توان با نرم افزارهای رایانه ای مورد تجزیه و تحلیل قرار داد و بدین صورت یک بانک اطلاعاتی از الگوهای الکتروفورتیک PFGE باکتریهای مختلف تهیه نمود. این بانک در مواقعی که با همه گیریهای یک سویه جدید مواجه میگردیم میتواند ارتباط فیلوژنتیکی آن را با سویه های مشابه مشخص سازد - . - 10PFGE در مقایسه با روشهای مولکولی دیگر که جهت تایپینگ استفاده میشوند از قدرت تشخیصی10 بالاتری برخوردار میباشد و در حال حاضر برای تایپینگ سویه های اشریشیا کلی، انتروکوکسی های مقاوم به وانکومایسین11 ، استافیلوکوکوس آرئوس، گونه های آسینتوباکتر12 پسودوموناس ایروژینوزا،سالمونلاها و مایکوباکتریوم اویوم مورد استفاده قرار گرفته است - . - 172 با این همه این روش خود دارای محدودیتهایی نظیر طولانی بودن مدت زمان تشخیص - 3؛2 روزجهت انجام PFGE لازم است - و اقتصادی نبودن است 10 - ، . - 12
-3 سوترن بلاتینگ13 و 14 RFLP
سالهاست که سوترن بلاتینگ برای تشخیص ترادف های ژنتیکی بسیاری از میکروارگانیسم های یوکاریوتی و پروکاریوتی مورد استفاده قرار میگیرد. برای انجام سوترن بلاتینگ ابتدا کروموزوم کامل باکتری را با آنزیمهای محدودیت اندونوکلئازی هضم نموده و سپس قطعات حاصله را درون یک ژل الکتروفورز می نمایند. قطعات DNA جدا شده را از ژل بر روی یک ورقه نیتروسلولز15 یا غشاء نایلونی16 منتقل و در مرحله بعد قطعات منتقل شده را با یک یا چند کاوشگر17 که هومولوگ ژن هدف هستند هیبرید می نمایند. کاوشگرها را میتوان با تعدادی از سوبسترا های کمیلومیناسنس18 و یا سوبستراهای رنگی آنزیمها19 نشانه گذاری نمود. تمایز سویه های باکتریایی بر اساس مشاهده الگوهای پلی مورفیک مختلف ناشی از جایگاه تأثیر آنزیمهای محدودیت در ژن هدف انجام میگیرد. اطلاق نام RFLP در واقع به معنی طبیعت پلی مورفیک محل تأثیر آنزیمهای اندونوکلئازی در یک ژن خاص است. تنها قطعات DNA که با کاوشگر هیبرید میگردند درRFLP قابل رؤیت میباشند. با انتخاب کاوشگرهای مختص جنس20 میتوان تحت تیپ های گونه های بروسلا، لژیونلا پنوموفیلا21 و پسودوموناس ایروژینوزا را شناسایی کرد. یکی از معایب این روش آن است که فقط قادر به تمیز سویه های بسیار نزدیک از هم میباشد 1 - ، . - 10
-4 آزمون 22 RAPD
آزمون RAPD که گاهی اوقات 23 AP - PCR خوانده میشود برای اولین بار توسط ویلیام و همکاران - 1990 - 24، ولش و مک کللند - 1990 - 25 معرفی گردید. این روش متکی بر استفاده از آغازگرهای کوتاه 10-9 باز است که قادرند بر روی توالی های مشابه DNA کروموزومی در شرایط دمای پایین اتصال آغازگرها به چسبند و این نواحی را افزوده سازی نمایند. چنانچه دو آغازگر در موقعیت مناسب خود در مولکول DNA اتصال یابند در آن صورت محصول PCR یک قطعه به
