مقاله روش های پیشرفته HPLC برای خالص¬سازی متابولیت¬های ارزشمند دارویی موجود در گیاهان

بخشی از مقاله

چکیده

روشهای پیشرفته کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، از مدرنترین روشهای جداسازی هستند که به محقق امکان میدهد تا متابولیتهای ارزشمند دارویی موجود در عصاره گیاهان را با خلوص بالا، در زمان کمتر وسرعت بالاجداسازی و خالصسازی کند. این روشهای پیشرفته، در تمام شاخههای علوم از شیمی، بیوشیمی تا بیوتکنولوژی و داروسازی کاربرد پیدا کرده است و رشد سریع خود را درطی سالهای اخیر, تا حدود زیادی به سرعت عمل، سادگی روش، و به کارگیری گسترده آن به عنوان وسیله جداسازی، مدیون است. از روشهای پیشرفته میتوان به two-dimensional HPLC، recycling HPLC و mix mode HPLC اشاره کردکه این تکنیکها توانایی زیادی در جداسازی و خالصسازی متابولیتهای ارزشمند از ماترکیس-های پیچیده گیاهی را دارند.

مقدمه

در سالهای اخیر به علت سرعت و حجم زیاد مبادلات علمی، بر دانش و دانایی عمومی اضافه گردیده و توجه انسانها به حفظ رعایت تندرستی و پیشگیری از بیماریها در حال رشد است. بخشی از این رشد به جهت استفاده از روشهای طب سنتی و تلفیق آن با طب مدرن است و در این راستا، بیشتر نگاهها متوجه مصرف گیاهان دارویی است. در نتیجه، تولید و مصرف داروهای با منشا گیاهی در سطح جهانی رو به افزایش است و بر سطح زیر کشت گیاهان دارویی سال به سال افزوده میگردد. استفاده از گیاهان دارویی و فراوردههای آنها نه تنها در کشورهای در حال توسعه، بلکه در کشورهای پیشرفته نیز موارد استفاده فراوان دارند و مصرف آنها رو به رشد سریع است.

از این رو گیاه دارویی نه تنها به صورت داروی محلی و در فروشگاههای غذاهای بهداشتی و عطاریها، بلکه به عنوان داروی رسمی و مورد تایید فارماکوپه، در داروخانههای معتبر ظاهر شده است و تجارت آن سود فراوانی برای کشورهای تولید کننده به جا گذاشته است. تحقیقات نشان داده است که گیاهان دارویی علاوه بر ترکیبات عمومی، هر کدام حداقل دارای یک ماده موثره ثانوی مخصوص میباشند. از این رو طی دهههای اخیر، کوششهای فراوانی برای دستیابی به این ماده فعال شده است.

تابحال مطالعات گسترده ای بر روی گیاهان انجام شده و این تحقیقات منجر به شناسایی گیاهانی شده اند که در پیشگیری و درمان سرطان موثرند. پتانسیل بالای این گیاهان و مواد موثره موجود در آنها که در درمان و پیشگیری سرطان موثر هستند باعث شده است که محققان گیاهان دارای خاصیت ضد سرطان را مورد بررسی بیشتر قرار داده و در جستجوی راهکاری برای استخراج، خالصسازی و شناسایی ترکیبات موثره آنها باشند. از جمله ماده موثره موجود در گیاهان که در درمان سرطان موثر بوده اند می توان به وین بلاستین و وین کریستین - گیاه پروانش - ، کورکومین - زردچوبه - ، آلسین - سیر - ، تاکسول - درخت سرخدار - ، آلوئین - آلوئه ورا - و ... اشاره کرد. این ترکیبات ضدسرطان در مقادیر بسیار پایین در گیاه وجود دارد و خالص سازی آنها از ماتریکس پیچیده دارای حائز اهمیت فراوانی است.

روش های مختلفی برای خالص سازی متابولیت های ارزشمند دارویی در مقیاس صنعتی وجود دارد که از مهمترین آنها می توان به preparative HPLC اشاره کرد. امروزه از این روش برای خالص سازی موادی مانند داروها، پلیمرها، مواد طبیعی و سنتزی استفاده میبرند. در این روش، برخلاف روش های معمول HPLC، ستون های مورد استفاده در ابعاد بزرگتری هست و عصاره حاوی ماده موثره گیاه به ستون تزریق می شود و بر اساس برهم کنش های متفاوتی که با فاز ساکن و فاز متحرک برقرار می کند باعث جداسازی ترکیبات از هم شده و بعد از خروج از آشکارساز، نمونه ها جداگانه در ظرف های مخصوص جمع آوری می شوند.

با توجه به هزینهی بالای این روش، هنگامی از این روش استفاده میشود که ترکیب مورد نظر ارزش اقتصادی بالایی داشته باشد و در ضمن روشهای شیمیایی و یا فیزیکی مناسبی موجود نباشد. از مزایای این روش در مقایسه با روشهای دیگر جداسازی میتوان به آلودگی کمتر، سرعت عمل، بهره و بازده بالا و همچنین از نقاط ضعف این روش به هزینهی بالای روش، مصرف زیاد حلالهای سمی و حساس بودن آن اشاره کرد.

ولی در بسیاری مواقع جداسازی و خالصسازی متابولیت های گیاهی با استفاده از این روش به علت جداسازی کم میان اجزای یک ترکیب، امکان پذیر نیست . بنابراین برای رسیدن به بهترین جداسازی و خالصسازی متابولیتهای موجود در گیاه، باید از روشهای پیشرفته کروماتوگرافی تهیه ای مایع با کارایی بالا بهره برد. از روشهای پیشرفته می توان به کروماتوگرافی تهیه ای دوبعدی، کروماتوگرافی مخلوط و کروماتوگرافی چرخشی اشاره کرد.

Two-dimensional HPLC -2

تکنیک2D-HPLC یکی از روشهای پیشرفته کروماتوگرافی است که برای جداسازی ترکیبات از ماتریکسهای پیچیده مورد استفاده قرار میگیرد. در این تکنیک، از دو ستون - با فازهای ساکن یکسان یا متفاوت - استفاده میشود و فاز متحرک مورد استفاده میتواند سیستم شویشی یکسان یا متفاوت داشته باشد. این تکنیک به دو روش comprehensive و heart cut انجام می گیرد.

Comprehensive HPLC  2-1

در تکنیک comprehensive، کلیه ترکیبات که وارد ستون اول شده اند بعد از جدا شدن از ستون اول وارد ستون دوم می شود تا جداسازی کلیه ترکیبات بهبود یابد. بر اساس مطالعاتی که توسط Wei و همکاران [1] انجام شد مشخص شد که این تکنیک، روشی مناسب برای جداسازی آلکالوئیدها در عصاره تام آلکالوئیدی گیاه Corydalis yanhusuoمی باشد و با کمک این روش موفق به شناسایی 16 ترکیب شدند - شکل . - 1همچنین، Li و همکاران [2] با کمک این تکنیک و با اتصال فاز نرمال به فاز معکوس موفق به جداسازی ترکیبات قطبی موجود در پوست نوعی قورباغه شدند.

Heart cut HPLC 2-2

در تکنیک heart cut ، بخشی از کروماتوگرام اولیه که جداسازی خوبی ندارد و نمیتوان به ماده موثره با خلوص بالا رسید وارد ستون دوم میشود و جداسازی این ماده یا دسته مواد افزایش مییابد. مطالعات انجام شده بر روی ترکیبات پلیفنولی موجود در پوست درخت بید نشان داد که با کمک این تکنیک می توان فرکشنهایی که بیش از یک ترکیب دارند و بخوبی با HPLC معمولی جدا نشدهاند جداسازی کرد و ترکیبات آن را مورد شناسایی قرار داد [3] - شکل . - 2 همچنین، قاسمپور و قهرمانزمانه موفق به جداسازی سیکلوتایدهای گیاه Viola ignobilis با کمک تکنیک heart cut شدند .[4]

Recycling HPLC -3

در تکنیکrecycling HPLC که در نمای آن در شکل 3 آورده شده است از یک ستون HPLC - از هر نوع فاز ساکن و هر نوع ابعادی که مدنظر است - استفاده میشود و نمونه ها بعد از خروج از آشکارساز، یکی پی از دیگری با استفاده از شیرکنترل دوباره به ستون برگردانده میشود. این عمل باعث می شود که ترکیبات دوباره به ستون وارد شده و بعلت طولانی شدن مسیر، تعداد برهمکنشهای آنها با فاز ساکن ستون بیشتر و ترکیبات بخوبی از هم جدا شوند. در این روش اگه هدف خالص سازی ترکیب خاصی باشد و آن ترکیب نیز جداسازی خوبی نداشته باشد می توان آن بخش از کروماتوگرام را دوباره به ستون وارد کرد و سعی در جداسازی بهتر آن کرد.

این عمل باعث می شود که ناخالص های موجود در کروماتوگرام به راحتی حذف شوند و جداسازی و خالص سازی ترکیب مورد نظر براحتی انجام شود. همچنین در این روش امکان برگرداندن جندین باره بخشی از کروماتوگرام - یا کل کروماتوگرام - به ستون وجود دارد و در هر سیکلی که تکرار می شود جداسازی نسبت به سیکل قبلی بهتر می شود. از دیگر مزایای این روش این است که مشکل فشار سیستم وجود ندارد و و در مصرف حلال نیز صرفه جویی میشود.

ولی معایبی که این روش دارد این است که رفته رفته پیک ها پهنتر شده و بعد چندین سیکل، پیکهای کوچک ناپدید میشوند و همچنین امکان کار کردن بصورت گرادیانت با این سیستم وجود ندارد .[5] بر اساس مطالعاتی که بر روی زردچوبه انجام شد معلوم شد که با استفاده از تکنیک recycling HPLC و طی 5 سیکل می توان متابولیتهایی دارویی تشکیل دهنده زردچوبه - کورکومین، دمتوکسی کورکومین و بیس دمتوکسی کورکومین - را با خلوص بالای 98 درصد تهیه کرد - شکل .[6] - 4