بخشی از مقاله
چکیده:
ژنAPAF1 در ناحیه هاپلوتایپ HH1 گاو هلشتاین قرار داشته و به طور موثری باعث کاهش باروری در گاو می شود. هدف از پژوهش حاضر شناسایی واریانت های آللی ژن APAF1 با روش PCR-SSCP در گاوهای هلشتاین در ایران بوده است. به این منظور 200 نمونه خون تهیه و استخراج DNA با کیت انجام شد. سپس یک جفت آغازگر اختصاصی با نرم افزار Oligo7 طراحی شد به طوری که یک قطعه از اگزون 11 این ژن که حاوی جهش موثر بر باروری گاو هلشتاین بود را تکثیر نمود. پس از PCR تعیین ژنوتیپ نمونه ها با روش SSCP انجام و فراوانی های ژنی و ژنوتیپی با نرم افزار POPGEN محاسبه شدند.
در این جایگاه دو آلل A و B و دو ژنوتیپ AA و AB به ترتیب با فراوانی های 96/5، 3/5 و 93 و 7 درصد مشاهده شدند. ژنوتیپ BB در نمونه های مورد مطالعه مشاهده نشد. با توجه به نقش این ژن در کاهش توانایی باروری گاو هلشتاین و با توجه به نتایج حاصل شده در این پژوهش بررسی سایر قسمت های ژن APAF1 از جمله ناحیه تنظیمی آن و ارتباط آن با صفات تولیدمثلی و تولیدی در جمعیت گاوهای شیری پیشنهاد می شود.
مقدمه:
باروری یکی از مهم ترین صفات برای پایداری و حفظ تولید در دامپروری است. برای مثال تولید شیر حاصل از یک بارداری موفق و تعداد زایمان ها در طول زندگی گاو است که برای حفظ سود آوری ضروری بوده و اگر عملکرد تولیدمثلی کاهش یابد منجر به ضرر و زیان اقتصادی خواهد شد، زیرا علاوه بر کاهش تولید شیر مجبور به جایگزینی حیوانات در گله برای حفظ اندازه گله خواهیم شد. اهمیت نسبی باروری و ارتباط صفات شیردهی با صنعت لبنیات، عملکرد تولید مثلی را به یک هدف بسیار مهم در برنامه های اصلاح نژادی گاو شیری تبدیل کرده است .
>Lucy, 2001; Shook, 2006@ در گاوهای پرتولید طولانی شدن فاصله زایش هزینه زیادی در بر دارد که عواملی مثل قیمت شیر، میزان تولید شیر، تفاوت در هزینه جایگزینی تلیسه، هزینه اسپرم، هزینه خوراک و هزینه تلقیح و ....روی آن تاثیر می گذارند .>Cochran et al., 2013@ طی دهه های اخیر، تولید شیر گاوهای شیری در اثر بهبود ژنتیکی به میزان قابل توجهی افزایش یافته است اما همزمان عملکرد تولیدمثلی آن ها به میزان قابل ملاحظه ای کاهش یافته و انتخاب برای افزایش تولید شیر و ترکیبات آن اثر نامطلوبی بر عملکرد تولید مثل و سلامتی داشته است VanRaden et al., ] >2004 عملکرد تولیدمثلی گاوهای شیری با فاکتورهایی از قبیل سن اولین زایش، فاصله بین دو زایش، روزهای باز و تعداد تلقیح به ازای آبستنی ارزیابی می شود >Nilforoshan and Edri, 2004@ .
فاکتور فعال کننده شماره یک پپتیداز آپوپتوزی - APAF1 - در حالت عادی در سلول به صورت بی اثر و غیر فعال حضور داشته و در پروسه آپوپتوز در اثر رهایی سیتوکروم-C از میتوکندری فعال می شود. وزن مولکولی این پروتئین 130 کیلو دالتون بوده و در انتهای آمینی دارای دامین CARD و در انتهای کربوکسیلی دارای چندین بخش تکراری از موتیف WD-40 می باشد. برای فعال شدن پروتئین APAF1 ایجاد میان کنش بین این پروتئین و سیتوکروم-C ضروری است. پروتئین کد شونده توسط APAF1 ترکیب کلیدی در فرایند آپوپتوزی به واسطه سیتوکروم-C می باشد َ.
>Apweiler et al., 2004@ اگر چه تا کنون پژوهش های متعددی در ارتباط با تاثیر ژن های در گیر در فرآیند تولیدمثل از جمله FSH، FSHR، اینهیبین، GnRH و ... بر صفات تولیدمثلی در گاو هلشتاین انجام شده است اما در اکثر موارد نتایج مطلوبی حاصل نشده است. اخیراً ژن های جدیدی از جمله APAF11 به عنوان ژن های موثر بر کاهش کارایی تولید مثلی در گاوهای هلشتاین شناسایی و معرفی شده اند . بنابراین هدف از پژوهش حاضر شناسایی واریانت های آللی ژن APAF1 با روش PCR-SSCP در گاوهای هلشتاین در ایران بوده است.
مواد و روش ها
تهیه نمونه های خون و استخراج :DNA
تعداد 200 نمونه خون از بانک خون آزمایشگاه ژنتیک مولکولی و بیوتکنولوژی دام دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری تهیه شده و استخراج DNA با روش نمکی بهینه یافته2 انجام شد. این روش که در سال 1988 توسط Miller و همکاران ارایه شد شامل لیز کردن سلول با یک دترجنت یا شوینده، حذف پروتئینها با نمک، کلروفرم و پروتیناز K و در نهایت رسوب DNA با اتانول میباشد.
تکثیر جایگاههای ژنی مورد مطالعه با استفاده از PCR
برای تکثیر قطعات مورد نظر که حاوی جهش های موثر بر کارآیی تولید مثل در گاو باشند، قطعه ای از اگزون 11 ژن APAF1 با استفاده از نرم افزار Oligo7 و توالی های استخراج شده از بانک ژنی با شماره های دسترسی AC_000162.1 طراحی شد.
تعیین ژنوتیپ به روش SSCP
برای شناسایی تنوع آللی و تعیین ژنوتیپ نمونه های مورد نظر، پس از تکثیر قطعات توسط آغازگرهای اختصاصی هر یک از ژنها، از روش SSCP استفاده خواهد شد. به این ترتیب که 5 میکرولیتر از محصول PCR را با 5 میکرولیتر از فرمامید % 95 شامل زایلن سیانول و برم فنول آبی مخلوط کرده، محلول حاصل را به مدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد حرارت میدهیم.
سپس نمونهها به سرعت و به مدت 10 دقیقه بر روی یخ قرار داده میشوند تا از اتصال مجدد رشتههای مکمل به یکدیگر ممانعت به عمل آید. مقدار 5 میکرولیتر از این نمونهها در داخل چاهکهای ژل عمودی پلی اکریل آمید ریخته شده و پس از الکتروفورز برای مشاهده الگوهای باندی و تعیین ژنوتیپ از رنگ آمیزی نیترات نقره استفاده شد.
نتایج و بحث
تعیین ژنوتیپ نمونه ها با روش SSCP وجود چند شکلی را در جایگاه ژنی مورد نظر در نمونه های مورد مطالعه از گاو هلشتاین نشان داد - شکل . - 1 به طوری که در این جایگاه دو آلل A و B به ترتیب با فراوانی های 96/5 و 3/5 درصد مشاهده شدند. همچنین دو ژنوتیپ AA و AB نیز به ترتیب با فراوانی های 93 و 7 درصد در نمونه های مورد مطالعه مشاهده شدند . ژنوتیپ BB در نمونه های مورد مطالعه مشاهده نشد که دلیل آن می تواند کم بودن تعداد نمونه های مورد مطالعه و یا مهم تر از آن انتخاب به نفع آلل A در جمعیت گاوهای هلشتاین در ایران باشد.
Adams و همکاران >2016@ با مطالعه هاپلوتایپ شماره یک گاو هلشتاین HH1 3 در گاو هلشتاین با روش تجزیه و تحلیل کامل ژنی با استفاده از داده های توالی یابی کل ژنوم نشان دادند که بروز یک جهش در اگزون 11 ژن APAF1 باعث کاهش کارآیی تولیدمثل در گاو هلشتاین می شود. بررسی های بیشتر نشان داد که این جهش یک جهش بد معنی بوده و باعث تبدیل کدن اسید آمینه گلوتامین به یک کدن خاتمه می شود . - p.Q579X - به طوری که بروز این جهش باعث کوتاه شدن 53/7 درصد - 670 اسید آمینه - از پروتئین کد شونده APAF1 خواهد شد. حذف این قطعه از پروتئین مورد نظر سبب حذف دامین عملکردی WD40 می شود. این دامین در کنش متقابل پروتئین-پروتئین نقش حیاتی ایفا می کند - آسهان و همکاران، . - 2002
