بخشی از مقاله
چکیده:
هدف از پژوهش حاضر شناسایی واریانت های آللی ژن SHBG با روش PCR-SSCP در گاوهای هلشتاین و مونبلیارد در ایران بوده است. به این منظور 250 نمونه خون 150 - نمونه هلشتاین و 100 نمونه مونبلیارد - تهیه و استخراج DNA با کیت انجام شد. سپس یک جفت آغازگر اختصاصی با نرم افزار Oligo7 طراحی شد به طوری که یک قطعه از اگزون 3 این ژن که حاوی جهش موثر بر باروری گاو هلشتاین و مونبلیارد بود را تکثیر نماید. پس از PCR تعیین ژنوتیپ نمونه ها با روش SSCP انجام و فراوانی های ژنی و زنوتیپی با نرم افزار POPGEN محاسبه شدند.
در این جایگاه دو ژنوتیپ AA و AB به ترتیب با فراوانی های 0/47 ، 0/53 و 0/04 و 0/96 درصد در دو نژاد هلشتاین و مونبلیارد مشاهده شدند. همچنین فراوانی های آللی در دو جعیت هلشتاین و مونبلیارد برای آلل های A و B به ترتیب 0/735، 0/235 و 0/52 و 0/48 برآورد گردید.
تست دقیق فیشر و تست کای-اسکوئر به ترتیب برای مقایسه فراوانی های آللی و ژنوتیپی بین دو جمعیت نشان داد که اختلاف آماری معنی داری از نظر فراوانی ژنی وجود ندارد اما فراوانی های ژنوتیپی با هم اختلاف معنی دار آماری - P<0.05 - نشان دادند. با توجه به نقش این ژن در کاهش توانایی باروری گاو هلشتاین و با توجه به نتایج حاصل شده در این پژوهش بررسی سایر قسمت های ژن SHBG از جمله ناحیه تنظیمی و اینترون های آن و ارتباط آن با صفات تولیدمثلی و تولیدی در جمعیت گاوهای شیری پیشنهاد می شود.
مقدمه:
در سال های اخیر بسیاری از کشورها به دلیل اهمیت اقتصادی زیاد، ارزیابی ژنتیکی صفات تولید مثلی و انتخاب برای بهبود باروری گاوهای شیری را در برنامه های اصلاحی خود قرار داده اند. تولید مثل در دام های مزرعه ای به عنوان یکی از مهم ترین بخش های مدیریت دامپروری از جایگاهی ویژه برخوردار است. علت این اهمیت را می توان در حفظ و نگهداری نسل، آماده نمودن بستری مناسب برای برنامه های اصلاح نژادی، پرواربندی و دوره های منظم شیردهی جستجو نمود.
عملکرد تولید مثلی نامناسب گاوهای شیری که به صورت افزایش فاصله گوساله زایی یا افزایش حذف اجباری گاوهای شیری و یا هر دو بروز می کند، سبب کاهش تولید شیر و گوساله زایی در سال می شود - . - Sewalem et al., 2010 اگرچه سطح تولید گله به خاطر رابطه ظاهراً منفی تولید شیر و تولید مثل گاوهای شیری، موضوع بسیاری از تحقیقات بوده است، با این حال مشخص شده است اثرات افزایش تولید شیر بر تولید مثل بیشتر در گاوهای شیری پر تولید مشاهده می شود
بسیاری از دامداران در گاوهای پرتولید خود با مساله ثبات یک عملکرد قابل قبول تولید مثلی مواجه می باشند. پیشرفت در مدیریت یا ژنتیک که منجر به بهبود میانگین برخیصفات، مثلاً کاهش روزهای باز می شود به تولید کننده اجازه می دهد تا از طریق افزایش تولید شیر، با راندمان بهتری به منافع اقتصادی دست یابد.
نتایج برخی تحقیقات نشان می دهد که در مورد برخی صفات تولید مثلی واریانس ژنتیکی قابل ملاحظه ای وجود دارد که در این صورت توسعه و پیشرفت در عملکرد تولیدمثلی، از طریق برنامه های انتخاب ژنتیکی نیز امکان پذیر خواهد بود
مهم ترین دلیل حذف گاوهای شیری در کشور مشکلات تولید مثلی است که نشان می دهد یکی از فاکتورهای مهم در گاوداری ها، خصوصیات تولید مثلی است. کارایی تولید مثل یک گاو از طریق سن اولین زایش، تعداد روزهای غیرآبستن، تعداد تلقیح به ازای آبستنی و فاصله بین دو زایش ارزیابی می شود
- Asai et al., 2003 - بیان کردند که ژن SHBG پروتئینی را کد می کند که به متابولیت های استروژن فعال مانند -2متوکسی استرادیول و هورمون های مردانه مانند تستوسترون متصل می شود. - Dunn et al., 1981 - بیان کردند که SHBG تولید شده توسط کبد یک پروتئین چرخه ای منتقل کننده استروئید است. در گردش عمومی کل تستوسترون به چهار بخش عمده طبقه بندی می شود: تستوسترون متصل به - %44 - SHBG، تستوسترون متصل به آلبومین - %50 - ، تستوسترون متصل به کورتیزول و گلوبولین - %4 - و تستوسترون آزاد - Longcope et al., 2000 - . - %2 - بیان کردند که کاهش تستوسترون می تواند منجر به کاهش عملکرد جنسی و توده ماهیچه و همچنین از دست رفتن تراکم استخوان گردد.
- Verstuyf et al., 2010 - اعلام کردند که پروتئین SHBG یک انتقال دهنده آندروژن می باشد که نرخ زدودگی1 هومورن های استروئیدی را با کنترل غلظت آن ها در پلاسما تنظیم می کند. - Ingraham et al., 2008; 5X et al., 2007 - گزارش کردند از آنجایی که تاکنون مدل حیوانی در مورد نقص در SHBG تشریح نشده است، اما چندین مثال از مرگ رویانی مرتبط با نقص در آنزیم های درگیر در سنتز استروئیدهای جنسی یا گیرنده های استروئیدی در موش گزارش شده اند، که نقش قابل توجه این هورمون ها را در طول توسعه و تکامل جنینی را پیشنهاد می کنند.
علاوه بر این - Duncan et al., 2001 - نشان دادند که فقدان در پروتئین- S - پارالوگ شناخته شده - SHBG، باعث اختلالات انعقادی کشنده جنینی در موش می شود . این مشاهدات وجود ارتباط بین نقص در SHBG و مشکلات در تولید مثل در گاو مونبلیارد را حمایت می کنند. بنابراین هدف از پژوهش حاضر شناسایی واریانت های آللی ژن SHBG با روش PCR-SSCP در گاوهای هلشتاین و مونبلیارد در ایران بوده است.
مواد و روش ها
تهیه نمونه های خون و استخراج :DNA
تعداد 150 نمونه خون گاو هلشتاین از بانک خون آزمایشگاه ژنتیک مولکولی و بیوتکنولوژی دام دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی ساری و تعداد 100 نمونه خون گاو مونبلیارد از بهکده رضوی تهیه شده و استخراج DNA با روش نمکی بهینه یافته2 انجام شد. این روش که در سال 1988 توسط میلر و همکارانش ارایه شد شامل لیز کردن سلول با یک دترجنت یا شوینده، حذف پروتئینها با نمک، کلروفرم و پروتیناز K و در نهایت رسوب DNA با اتانول میباشد.
تکثیر جایگاههای ژنی مورد مطالعه با استفاده از PCR
برای تکثیر قطعات مورد نظر که حاوی جهش های موثر بر کارآیی تولید مثل در گاو باشند، قطعه ای از اگزون 3 ژن SHBG با استفاده از نرم افزار Oligo7 و توالی های استخراج شده از بانک ژنی با شماره های دسترسی AC_000176.1 طراحی شد
جدول .1 توالی آغازگرهای طراحی شده در پژوهش حاضر
تعیین ژنوتیپ به روش SSCP
برای شناسایی تنوع آللی و تعیین ژنوتیپ نمونه های مورد نظر، پس از تکثیر قطعات توسط آغازگرهای اختصاصی هر یک از ژنها، از روش SSCP استفاده خواهد شد. به این ترتیب که 5 میکرولیتر از محصول PCR را با 5 میکرولیتر از فرمامید % 95 شامل زایلن سیانول و برم فنول آبی مخلوط کرده، محلول حاصل را به مدت 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد حرارت میدهیم. سپس نمونهها به سرعت و به مدت 10 دقیقه بر روی یخ قرار داده میشوند تا از اتصال مجدد رشتههای مکمل به یکدیگر ممانعت به عمل آید. مقدار 5 میکرولیتر از این نمونهها در داخل چاهکهای ژل عمودی پلی اکریل آمید ریخته شده و پس از الکتروفورز برای مشاهده الگوهای باندی و تعیین ژنوتیپ از رنگ آمیزی نیترات نقره استفاده شد.
تعیین فراوانیهای ژنی و ژنوتیپی
برای تعیین فراوانی های ژنی و ژنوتیپی در جایگاه مورد نظر از نرم افزار POPGEN و مدل زیر استفاده شد:
p = 2 - AA + AB - / 2N
q = 2 - BB + AB - / 2N
:p فراوانی الل A، :q فراوانی الل B، :AA تعداد افراد با ژنوتیپ AA، :BB تعداد افراد با ژنوتیپ BB، :AB تعداد افراد با ژنوتیپ هتروزیگوت، :N تعداد کل افراد میباشد.
آنالیز آماری
با توجه به اینکه دو جمعیت در پژوهش حاضر مورد بررسی قرار گرفته بودند، فراوانی های آللی و ژنوتیپی بین دو جمعیت به ترتیب با تست دقیق فیشر و آزمون کای-اسکوئر مورد مقایسه قرار گرفتند.
نتایج و بحث
تعیین ژنوتیپ نمونه ها با روش SSCP وجود چند شکلی را در جایگاه ژنی مورد نظر در نمونه های مورد مطالعه از گاو هلشتاین و مونبلیارد نشان داد - شکل . - 1 در این جایگاه دو ژنوتیپ AA و AB به ترتیب با فراوانی های 47 ، 53 و 4 و 96 درصد در دو نژاد هلشتاین و مونبلیارد مشاهده شدند. همچنین فراوانی های آللی در دو جعیت هلشتاین و مونبلیارد برای آلل های A و B به ترتیب 0/735، 0/235 و 0/52 و 0/48 برآورد گردید - جدول . - 2 تست دقیق فیشر و تست کای-اسکوئر به ترتیب برای مقایسه فراوانی های آللی و ژنوتیپی بین دو جمعیت نشان داد که اختلاف آماری معنی داری از نظر فراوانی ژنی وجود ندارد اما فراوانی های ژنوتیپی با هم اختلاف معنی دار آماری - P<0.05 - نشان دادند.
