بخشی از مقاله
چکیده
میکروآرانآها، RNA های غیرکدکنندهی کوچکی هستند که در بسیاری از پاسخهای فیزیولوژیکی و پاتولوژیکی نقش دارند. میکرو آر ان آ bta-mir-152 با تنظیم بیان ژن PTGS2 که در مسیرهای متابولیسمی اسیدهای چرب موجود در سلولهای اپیتلیال پستانی گاوها نقش کلیدی دارد، نقش مهمی را در میزان چربی شیر ایفا می کند. لذا این پژوهش با هدف بررسی فرم های مختلف آللی در pri- mir میکرو آر ان آ bta-mir-152 در گاوهای نژاد هلشتاین و مونبلیارد صورت گرفت.
در این مطالعه از 200 راس گاو هلشتاین و 100 راس گاو مونبلیارد به صورت تصادفی خونگیری انجام و DNA نمونه ها با استفاده از کیت استخراج گردید. سپس یک جفت آغازگر اختصاصی برای تکثیر قسمتی از pri-mir-152 به طول 441 جفت باز، با نرم افزار Oligo7 طراحی شد. پس از تکثیر PCR، تعیین ژنوتیپ نمونه ها با روش SSCP انجام شد. نتایج حاصل از برآورد فراوانی های ژنی و ژنوتیپی با نرم افزار POPGEN وجود دو آلل A و B و دو ژنوتیپ AA و AB را در جایگاه نشانگر pri-mir-152 نشان داد.
مقدمه
میکروآرانآها، RNA های غیرکدکنندهی کوچکی هستند که در miRNA های بالغ به طور خاص به نواحی3"UTR1 در mRNA2 مهار ترجمه میشوند . - Liu et al ., 2013 - بسیاری از پاسخهای فیزیولوژیکی و پاتولوژیکی نقش دارند. های سلول هدف متصل شده و سبب تخریب mRNA هاو یا miRNA ها از روی میکروآرانآهای اولیهی بلند - pri-miRNAs - 3، پیشسازهای miRNA ها - pre-miRNA - 4 و مولکول های stem-loop به اندازهی 70-55 نوکلئوتید رونوشت میشوند. در فرآیند ساخته شدن، Pre-miRNA ها از طریق کمپلکسی که توسط آنزیم DROSHA و پروتئین DCGR85 تشکیل شده است، شکسته میشوند.
همزمان با انتقال آنها از هسته به سیتوپلاسم که از طریق پروتئین Exportin5 و پروتئینهای هستهای ran-GTP انجام میشود، pre-miRNA توسط DICER1 پردازش میشود. مولکولهای دو رشتهای حاصل شده شامل توالی miRNA بالغ و یک رشتهی miRNA مکمل هستند که رشته-ی مکمل جدا و تخریب میشود در حالیکه رشتهی miRNA بالغ وارد کمپلکس القاکنندهی خاموشی - RISC - 6 شده و با پروتئین های Argonaute ترکیب میشود .
- Khororova et al ., 2003 ; Lee et al., 2002 - میکروآرانآ bta-mir-152 روی کروموزوم 19 گاو قرار داشته و طول توالی اولیهی آن 2486 جفت باز، توالی پیش ساز آن 98جفت باز و miRNA بالغ آن 21 نوکلئوتید است . - Jin et al., 2009 - این miRNA بیان DNA متیل ترانسفراز 1 را تنظیم میکند و در شیردهی غدد پستانی در گاو شیری نقش دارد. bta-mir-152 از طریق تنظیم منفی بیان DNA متیل ترانسفراز 1، متیلاسیون کلی DNA و فعالیت DNA متیل ترانسفراز را به منظور فعال سازی مجدد ژنهایی که سیگنالهای شیردهی را هدایت میکنند، کاهش میدهد .
- Wang et al ., 2014 - شن و همکاران در سال 2016 نشان دادند که پروستاگلندین اندوپروکسیداز سنتاز - PTGS2 - 7 2 که در مسیرهای متابولیسمی اسیدهای چرب موجود در سلولهای اپیتلیال پستانی گاوها نقش کلیدی دارد، توسط میکروآرانآ bta-miR-152 تنظیم میشود. فلذا هدف از پژوهش حاضر بررسی رفتار آللی pri-mir میکرو آر ان ای bta-mir-152 در گاوهای نژاد هلشتاین و مونبلیارد خواهد بود.
مواد و روش ها
نمونه برداری و استخراج DNA
پس از انتخاب افراد به صورت تصادفی، خونگیری حیوانات با استفاده از ورید دمی با استفاده از ونوجکت حاوی EDTA انجام شد. سپس نمونه ها در مخزن حاوی یخ جمع آوری شده و به آزمایشگاه ژنتیک مولکولی و بیوتکنولوژی دام گروه علوم دامی دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی ساری، منتقل و تا زمان استخراج DNA، در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. استخراج DNA طبق دستوالعمل کیت شرکت یکتا تجهیز آزما انجام و نمونه ها پس از شماره گذاری در فریزر -20 نگهداری شدند.
طراحی آغازگرهای اختصاصی
در این تحقیق به منظور تکثیر قطعه ی 441 جفت بازی در pri-mir میکرو آر ان ای bta-mir-152 از آغازگر طراحی شده با نرم افزار الیگو استفاده گردید.
واکنش زنجیره ای پلیمراز - PCR -
واکنش زنجیره ای پلیمراز شامل 1 میکرولیتر DNA الگو، 1 میکرولیتر آغازگر رفت، 1 میکرولیتر آغازگر برگشت، 10 میکرولیتر مستر میکس دو قطعه آغازگر و مستر میکس - حاوی آنزیم DNA پلیمراز، dNTP ها و بافر پی سی آر - و 7 میکرو لیتر آب دیونیزه در حجم کلی 20 میکرولیتر انجام شد. تکثیر قطعه ی مورد نظر، با استفاده از یک مرحله ی ابتدایی واسرشته سازی در دمای 95œC مدت 5 دقیقه و 35 چرخه شامل واسرشته سازی در دمای 95œC به مدت 30 ثانیه، دمای اتصال آغازگر 63œC به مدت 45 ثانیه و دمای تکثیر 72œCبه مدت 30 ثانیه و یک دمای تکثیر نهایی 72œCبه مدت 10 دقیقه با استفاده از دستگاه ترموسایکلر - Techne TC-3000G و - Corbett انجام گردید.
تعیین ژنوتیپ محصولات PCR ژن های مورد نظر روی ژل پلی آکریل آمید - روش - SSCP برای مشاهده قطعات حاصل از PCR ژن های مورد مطالعه، از ژل پلی آکریل آمید 10% استفاده شد. 4 میکرولیتر از محصول PCR با 8 میکرولیتر از بافر بارگذاری مخلوط وبه مدت 10 دقیقه داخل دستگاه PCR با دمای 90 درجه سانتی گراد قرار داده تا DNA تک رشته ای شود.
سپس نمونه ها به سرعت به داخل یخچال منتقل شدند تا از به هم چسبیدن دوباره ی رشته های مکمل ممانعت به عمل آید - . - Genxi. et al . 2012 به منظور مشاهده ی ژنوتیپ ها از دستگاه الکروفورز عمودی مدل VSTA-1002A استفاده شد. محصولات PCR تک رشته ای به مدت 19 ساعت با ولتاژ 300 ولت روی ژل آکریل آمید 10% الکتروفورز و به وسیله ی نیترات نقره رنگ آمیزی شدند - . - Benbouza.et al.2006
