بخشی از مقاله
چکیده
با توجه به شناسایی miRNA ها در سال های اخیر و افزایش شناخت ما از مکانیسم و تاثیر آن ها در چگونگی کنترل بیان ژن ها، زمینه های مطالعاتی جدیدی جهت بهبود صفات کمی و کیفی مرتبط به تولیدات دامی ایجاد شده است. در پژوهش حاضر جهت شناسایی فرم های مختلف آللی در ناحیه pri-miR423 از 150 راس گاو هلشتاین و 100 راس گاو نژاد مونبلیارد خونگیری به عمل آمد.
استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج و تکثیر یک قطعه 326 جفت بازی از ناحیه در بر گیرنده Pre-miR-423 توسط واکنش زنجیره ای پلی مراز صورت گرفت. تعیین ژنوتیپ نمونه ها با استفاده از روش PCR-SSCP و رنگ آمیزی نیترات نقره انجام شد. در این تحقیق، تنها یک الگوی باندی شناسایی شد که حاکی از مونومورف بودن این جایگاه در گاوهای مورد مطالعه بوده است. بررسی سایر قسمت های این ژن و همچنین مطالعه روی جمعیت های بزرگ تر در مطالعات آینده پیشنهاد می شود.
مقدمه
روزانه میلیاردها نفر در سراسر جهان از محصولات لبنی و سایر تولیدات دامی استفاده می کنند. شیر و محصولات لبنی نقش مهمی در تغذیه انسان ها ایفا می کنند، به همین دلیل بهبود صفات مطلوب کمی و کیفی در تولیدات دامی بسیار پر اهمیت و همواره مورد توجه اصلاح گران بوده است. پیشرفت های علمی و تکنولوژی تاثیر بسیار زیادی بر تولیدات دامی داشته اند. اگر چه در طی قرن گذشته انتخاب بر اساس فنوتیپ و شجره تاثیر چشم گیری بر بهبود صفات اقتصادی داشته است، اما در دهه های اخیر منبع جدیدی از اطلاعات به نام چند شکلی های ژنتیکی در دسترس قرار گرفته است.
وجود تنوع ژنتیکی برای انتخاب و اصلاح نژاد ضروری است. در سال های اخیر استفاده از چند شکلی های تک نوکلئوتیدی به عنوان مارکرهای ژنتیکی جهت شناسایی تنوع در سطح دی ان آ و استفاده از آن ها در اصلاح نژاد جهت انتخاب صفات مطلوب دام گسترش یافته و اثرات مشهودی بر بهبود صفات مورد انتخاب گذاشته است. شناسایی و بررسی چند شکلی ها و ارتباط آن ها با صفات مختلف در تحقیقات متعددی در بخش های مختلف ژنوم دام های اهلی مورد بررسی قرار گرفته است.
با توجه به شناسایی miRNA در سال های اخیر و افزایش شناخت ما از مکانیسم های مربوط به نحوه بیان و تاثیر آنها بر کنترل بیان ژن ها، زمینه تازه ای برای بررسی و استفاده از این مارکر ها بوجود آمده است.چند شکلی های بسیاری که در نواحی غیر کد کننده دی ان آ اتفاق می افتند ممکن است روی فرایند های بیولوژیکی مانند اتصال فاکتور رونویسی، splicing و تجزیه mRNA اثر بگذارند - Li et al, . - 2014 فلذا انجام تحقیق در ارتباط با این نواحی که از عناصر تنظیمی بسیار مهم در بیان ژن ها می باشند، افق جدیدی را پیش روی کارشناسان و محققین قرار داده است.
یکی از مکانیسم های کنترل بیان ژن از طریق miRNA می باشد که شامل خانواده بزرگی از RNAهای حدوداً 21 نوکلئوتیدی هستند که به عنوان تنظیم کننده های کلیدی پس از رونویسی بیان ژن را در حیوانات و گیاهان تنظیم می کنند. در طی سال های اخیر این مولکول ها فهم ما را از تنظیم بیان ژن پس از رونویسی متحول کرده اند . - Krol et al, 2010 -
miRNAs1 با خانواده پروتئین های آرگونات مرتبط هستند و هسته اصلی کمپلکس القا کننده خاموشی - miRISC2 - را تشکیل می دهند. به عنوان جزئی از کمپلکس miRISC، miRNA با mRNA هدف جفت می شود و کاهش بیان یا دآدنیله شدن و یا تجزیه آن ها را القا می کند. اغلب miRNA های حیوانی به صورت ناقص با ناحیه 3ʼUTR جفت می شوند و سنتز پروتئین را با کاهش بیان یا دآدنیله کردن و تخریب mRNA مهار می کنند . - Krol et al, 2010 -
miRNA ها نخست از روی ژن های خاصی توسط RNA Polymerase II رونویسی می شوند که به آن ها pri-miRNA3 گفته می شود. در ادامه Pri-miRNA چندین مرحله بلوغ را طی می کند تا pre-miRNA4 سنتز می شود. Pri-miRNA حاوی توالی miRNA بالغ می باشد. Drosha فرآیند ایجاد miRNA بالغ را با حذف کردن لوپ و آزاد کردن یک RNA لوپ دار حدودا 65 نوکلئوتیدی - pre-miRNA - آغاز می کند. آنزیم Drosha همراه با کوفاکتور ضروری خود DGCR8 - Pasha - کمپلکسی به نام میکروپروسسور - Microprocessor - را شکل می دهند.
همچنان که Drosha انتهای میکروآران آ را مشخص می کند مهم است که میکروپروسسور pri-miRNA را شناسایی کند و آن را برش دهد. جهش پایه - Basal junction - به عنوان نقطه مرجع اصلی برای جایگاه برش عمل می کند اما جهش ابتدای - apical junction - hairpin هم در پردازش موثر و دقیق miRNA مهم است. miRNA توسط کمپلکس Exportin5 از هسته به سیتوپلاسم منتقل می شود و در آنجا اندونوکلئاز DICER1 با پردازش آن یک قطعه کوچک دو رشته ای miRNA/miRNA بوجود می آورد.
رونویسی ژن های miRNA، پردازش pre-miRNA، انتقال از هسته به سیتوپلاسم توسط Exportin5 و پردازش pre-miRNA سیتوپلاسمی همگی تحت فرایندهای تنظیمی بسیار دقیق ایجاد می شوند . - Ha & Kim, 2014 - miRNA بالغ در کمپلکس RISC قرار می گیرد و توالی آن در ناحیه seed مجموعه هدف را تشخیص می دهد. جهش در هر قسمت از ناحیه پیش ساز miRNA می تواند سبب تغییر در ساختار hairpin شود.
در جابجایی - seed shifting - seed شکل miRNA بالغ به علت تغییر در پردازش Drosha و Dicer تغییر می کند، در نتیجه تغییر در انتهای 5ʼ توالی جدید seed وارد عمل شده و سبب شناسایی هدف جدیدی می شود. چون توالی miRNA بالغ قرار گرفته در کمپلکس RISC5 تعیین کننده اولیه مجموعه هدف برای یک miRNA می باشد، فلذا مکانیسم هایی که سبب تغییر در توالی miRNA بالغ می شوند زمانی که تکامل miRNA مد نظر باشد در مرکز توجه قرار می گیرند.
این مکانیسم ها شامل جهش هایی هستند که مستقیما در توالی miRNA بالغ و همچنین جهش هایی که در pre-miRNA رخ می دهند که سبب تغییر در ساختار hairpin و در نتیجه تغییر در شناسایی Dicer و Drosha و اتصال miRISC می شوند. کنترل بیان ژن توسط miRNA نیازمند واکنش مستقیم بین miRNA بالغ و mRNA هدف می باشد. تنوع ژنتیکی در ژن هدف با بوجود آوردن یا از بین بردن یک جایگاه هدف می تواند بر تنظیم آن توسط miRNA تاثیر بگذارد . - Berzikov,
چند شکلی های تک نوکلئوتیدی در microRNA می توانند روی شناسایی جایگاه هدف و کارایی تنظیم بیان ژن اثر بگذارند . - Li et al, 2014 - وانگ و همکاران در سال 2015 اثر چند شکلی در pre-miR 1666 را بر عملکرد مرغ بررسی نموده و نشان دادند که چند شکلی شناسایی شده به طور مشهودی با وزن لاشه، ، وزن ماهیچه سینه، وزن ران و همچنین وزن ماهیچه ران ارتباط دارد. برای صفات رشد، ارتباط معنی داری بین این چند شکلی و برخی شاخص های اندازه بدن شامل ابعاد ساق پا، قفسه سینه، طول استخوان سینه و طول بدن در 4، 8 و 12 هفتگی مشاهده شد.
- Li et al, 2015 - اثر چند شکلی را در miRNA 1606 روی صفات رشد و لاشه مرغ بررسی نموده و نشان دادند که چند شکلی در pre-miR 1606 اثر معنی داری بر وزن بدن در 10 هفتگی و 12 هفتگی دارد. همچنین چند شکلی در این ناحیه اثر معنی داری بر طول ساق پا، عمق قفسه سینه، طول بدن، زاویه سینه ای و عرض لگن خاصره در 12 هفتگی داشت. در این تحقیق، اثر چند شکلی بر صفات لاشه، وزن ماهیچه سینه، وزن ران و وزن لاشه معنی دار بود.
- Xiaopeng et al, 2016 - ارتباط چند شکلی در جایگاه اتصال miRNA در 3ʼUTR ژن Caprin KITLG را با نرخ چند قلو زایی در بز شیری گوانژانگ - Guanzhong - بررسی نموده و بیان کردند که دو آلل چند شکلی c.1457 A>C سبب ایجاد دو جایگاه اتصال miRNA شدند، در حالی که دو چند شکلی دیگر هیچ اثری بر جایگاه های هدف miRNA نداشتند.
- Zhang et al , 2015 - اثر چند شکلی را در جایگاه هدف bta-miR-53 و bta-miR-204 بر صفات کیفی اسپرم هلشتاین چینی بررسی نموده و بیان کردند که نرهای با ژنوتیپ GG در لوکوس g.528 G>A کاهش نرخ نقص ظاهری اسپرم معنی داری نسبت به ژنوتیپ های AA و GA داشتند. - Li et al, 2015 - همبستگی بین چند شکلی در pre-miR 1757 و صفات عملکرد مرغ را بررسی نموده و بیان کردند که همبستگی قابل ملاحضه ای بین ژنوتیپ چند شکلی pre-miR 1757 و صفات لاشه مشاهده شد. همچنین این چند شکلی ارتباط معنی داری با وزن بدن در 10 هفتگی، طول ساق پا در 4 هفتگی، زاویه سینه در 8 هفتگی، طول بدن و عرض لگن خاصره در 12 هفتگی داشت.
مواد و روش ها
از تعداد 150 رأس گاو نژاد هلشتاین و صد راس گاو نژاد مونبلیارد با استفاده از ونوجکت های EDTA دار خونگیری به عمل آمد و نمونه ها تا زمان استخراج DNA در دمای -20 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. استخراج DNA با استفاده از کیت استخراج DNA شرکت یکتا تجهیز آزما، کمیت و کیفیت DNA استخراج شده به ترتیب با استفاده از ژل آگارز 1 درصد در ولتاژ 87 ولت و رنگآمیزی با اتیدیوم بروماید انجام گرفت.
