بخشی از مقاله
چکیده
آسیل کوانزیم آ دي آسیل گلیسرول آسیل ترانسفراز - DGAT1 - 1 آنزیم کلیدي درگیر در کاتالیز مرحله نهائی سنتز تريگلیسرید میباشد. شناخت مسیرهاي متابولیکی سنتز تريگلیسرید و نقش آنزیمهاي درگیر در این واکنشها ممکن است به درك بهتر چگونگی ذخیره شدن چربی در بافت هاي ذخیرهاي و چگونگی مورد استفاده قرار گرفتن آن کمک کند. هدف این پژوهش بررسی تأثیر چندشکلی آللی در ناحیه 5′ UTR ژن DGAT1 گوسفند بر روي پروفیل چربی خون بود. براي این منظور تعداد 97 رأس از برههاي نر با سنتقریباًکسان گله اصلاح نژادي گوسفندان آمیخته افشاري x برولا مرینو مزرعه آموزشی- پژوهشی دانشگاه زنجان مورد استفاده قرارگرفت. جهت تهیه پلاسما و استخراج DNA خونگیري از سیاهرگ وداج انجام گرفت. غلظت تريگلیسرید، کلسترول، HDL، LDL و VLDL اندازه گیري شد. جهت بررسی چندشکلی، قطعه 566 bp ناحیه 5′ UTR ژن DGAT1 با استفاده از PCR تکثیر گردید. با استفاده از تکنیک SSCP و به دنبال آن نتایج تعیین توالی سه ژنوتیپ CC، CA و AA مشخص گردید. در ژنوتیپ AA کلسترول و HDL کمتري مشاهده شد، هرچند که تفاوت بین ژنوتیپ CA و AA معنیدار نبود اما تفاوت ژنوتیپ AA با ژنوتیپCC از لحاظ دو فراسنجه مذکور معنیدار - P <0/05 - بود.
کلمات کلیدي: پروفیل چربی خون، ژن DGAT1، گوسفند آمیخته افشاري x برولا مرینو
مقدمه
هدف اصلی در پرورش دامهاي گوشتی به دست آوردن حداکثر رشد بافت عضلانی با حداقل هزینه خوراك و اجتناب از ذخیره چربی اضافی در لاشه می باشد. ژن هاي درگیر در متابولیسم اسیدهاي چرب به عنوان ژنهاي بالقوه در تردي گوشت مورد توجه قرار می گیرند. یکی از آنزیمهاي کلیدي درگیر در کاتالیز مرحله نهائی سنتز تريگلیسرید، آسیلکوآ: دي آسیلگلیسرول آسیل ترانسفراز - DGAT1 - 1 میباشد که نقش مهمی در متابولیسم تريگلیسرولیپیدها بازي میکند . - 1,5 - در یوکاریوتها، اسیدهاي چرب به صورت تريگلیسرید در سیتوپلاسم آدیپوسیت ها ذخیره میشوند تا ذخایري براي تشکیل و ثبات غشا، نقل و انتقال لیپوپروتئین، دفع مسمومیت اسیدچرب و سوبستراهاي الکل، یکپارچگی پوست، و سوخت در زمان استرس یا نبود تغذیه فراهم آورند . - 4,7 - در انتروسیتها و هپاتوسیتهاي بیشتر پستانداران، تريگلیسرید به منظور تجمع و ترشح لیپوپروتئینها سنتز می شوند، که اسیدهاي چرب سنتزشده داخلی و غذا را بین بافتها انتقال دهند. هم بافت آدیپوز و هم کبد حاوي مقادیر زیادي آنزیم لیپوپروتئین لیپاز میباشند که باعث آزاد شدن اسیدهاي چرب و گلیسرول میشوند. اسیدهاي چرب آزاد شده به سلولهاي چربی بافت آدیپوز و کبد نفوذ کرده و به تريگلیسریدها تبدیل میشوند. VLDLها تريگلیسریدهاي سنتزشده در کبد را به بافت آدیپوز انتقال میدهند، در حالی که لیپوپروتئینهاي دیگر در مراحل مختلف انتقال فسفولیپید و کلسترول از کبد به بافتهاي محیطی اهمیت دارند . - 2 - درك مسیرهاي متابولیکی سنتز تريگلیسرید و نقش آنزیمهاي درگیر در این واکنشها ممکن است به درك بهتر چگونگی ذخیره شدن چربی در بافت هاي ذخیرهاي و چگونگی مورد استفاده قرار گرفتن آنها کمک کند. هدف این پژوهش بررسی تأثیر چندشکلی در ناحیه 5′ UTR ژن DGAT1 بر روي پروفیل چربی خون در آمیختههاي افشاري x برولا مرینو می باشد.
مواد و روشها
جهت اجراي تحقیق تعداد 97 رأس از برههاي نر با سنتقریباًکسان - 11ماهگی - گله اصلاح نژادي گوسفندان آمیخته افشاري x برولا مرینو مزرعه آموزشی- پژوهشی دانشگاه زنجان استفاده گردید. تمامی گوسفندان از تغذیه یکسان برخوردار بودند. جهت خونگیري و تهیه نمونهها از ونوجکت خلأدار 5 میلی لیتري حاوي ماده ضدانعقاد EDTA استفاده شد. خونگیري از سیاه رگ وداج صورت گرفت. نمونهها در ظرف محتوي یخ به آزمایشگاه منتقل و جهت تهیه پلاسما نمونههاي خون در دور 200 × g به مدت10 دقیقه در دماي چهار درجه سانتیگراد سانتریفیوژ گردید و استخراج DNA از خون با استفاده از روش فنول-کلروفرم انجام گرفت. غلظت تريگلیسیرید و کلسترول کل در پلاسما به روش اسپکتوفتومتري و میزان -HDLکلسترول به روش رسوبی اندازهگیري شد. مقدار VLDL و LDL با معادلات زیر برآورد گردید.
پرایمر هاي طراحی شده قطعه 566 bp ناحیه 5′ UTR ژن DGAT1 به صورت زیر بود:
هر مخلوط واکنش - 25µl - PCR شامل 16 پیکو مول از هر پرایمر، 100 نانوگرم DNA ژنومیک، IU 0/8 تکپلیمراز، 0/1µl بافرPCR، 200 µM از هرdNTP - شرکت سیناژن - ، MgCl2 2mM و KCl 50 mM بود، به علت بالابودن GC از تسهیل کننده هاي PCR شامل DMSO به غلظت %6/7 و BSA به غلظت 55 µg/ml استفاده گردید. سیکل حرارتی PCR به صورت زیر استفده شد: مرحله واسرشتگی اولیه به مدت شش دقیقه با دماي 96˚C، 30 چرخه شامل سه مرحله: 96˚C یک دقیقه، دماي اتصال 55˚C یک دقیقه، 72˚C یک دقیقه و 30 ثانیه و یک چرخه گسترش نهایی72˚ C پنج دقیقه. محصولات PCR به مدت 13 دقیقه در دماي 95 درجه سانتیگراد واسرشته شده و بر روي ژل آکریلامید 12% جهت انجام SSCP بارگزاري شدند. از این تکنیک جهت شناسایی چندشکلی موجود در این ناحیه استفاده شد. از هر گروه ژنوتیپی مشاهده شده یک نمونه انتخاب، و توسط آنزیم PFU تکثیر وتعیین توالی گردید. ارتباط داده هاي به دست آمده از اندازه گیري هاي پروفیل خون و نتایج چندشکلی ژن مذکور با در نظر گرفتن اثر ژنوتیپ به عنوان اثر ثابت، بر طبق مدل آماري زیر =Y - هریک از مشاهدات، =µ میانگین جامعه و =G اثر ژنوتیپ - توسط نرم افزار SPSS تجزیه و تحلیل شد.
نتایج و بحث
با استفاده از PCR قطعه 566 bp ناحیه 5′ UTR ژن DGAT1 تکثیر گردید - شکل . - 1 بر اساس مقایسه نتایج SSCP - شکل - 2 و توالی یابی، سه ژنوتیپ تشخیص داده شد. چند شکلی تک نوکلئوتیدي در GC Box ناحیه 5′ UTR در نوکلئوتید 127مشاهده شد که نشان دهنده دو آلل A و C در این جایگاه بود. آماره هاي به دست آمده از پارامترهاي خونی تريگلیسرید، کلسترول، HDL، LDL، VLDL در جدول 1 خلاصه شده است.
شکل-1 الکتروفورز فرآوردههاي PCR، ناحیه 5′ UTR ژن DGAT1 بر روي ژل آگارز %1، :L نشانگر 100 bp، :NC کنترل منفی
شکل-2 سه ژنوتیپ حاصل از مقایسه SSCP و توالییابی
جدول -1 آمارههاي به دست آمده از پارامترهاي خونی گوسفند آمیخته افشاري x برولا مرینو
داده ها بر اساس سه ژنوتیپ تشخیص داده شده گروهبندي و آنالیز گردیدند. تجزیه واریانس اثر ثابت ژنوتیپ روي پارامترهاي خونی مورد آزمون قرار گرفت که این اثر بر روي کلسترول و HDL معنیدار - - P <0/05 بود. نتایج آنالیز آماري پارامترهاي خونی به تفکیک گروه ژنوتیپی در جدول 2 نشان داده شده است. بین ژنوتیپهاي مختلف از لحاظ غلظت تريگلیسرید، LDL و VLDL تفاوت معنیداري مشاهده نشد. اما همانطوري که در شکل 3 مشاهده میشود میانگین کلسترول براي ژنوتیپ CC و AA به ترتیب برابر 51/87 و 45/69 میلیمول بر لیتر بوده و تفاوت بین آنها معنیدار - - P <0/05 بود. همچنین میانگین HDL براي ژنوتیپ CC و AA به ترتیب برابر 29/47 و 26/3 میلیمول بر لیتر بود که از لحاظ آماري این تفاوت معنیدار بود.
جدول-2 میانگین و S.E.M پروفیل چربی خون به تفکیک گروه ژنوتیپی CC، CA، AA مربوط به ژن DGAT1
حروف مختلفa،b در هر ردیف نشان دهنده اختلاف معنیدار - - P< 0/05 است.
