بخشی از مقاله
چکیده
انتقال وگذر مریستم راس شاخساره از فاز رویشی به زایشی، یک مرحله نموی کلیدی در سیکل زندگی گیاه است. گذر به گلدهی نیازمند فعال شدن مجموعهای از ژنها در مریستم راس شاخساره است که آن را از حالت رویشی به مریستم گل یا گلآذین تبدیل مینماید، ژن FLC یا ژن مهارگر گذر به گلدهی، نقشی کلیدی در کنترل زمان گلدهی دارد. هدف از این پژوهش طراحی پرایمر، استخراج، شناسایی و تعیین توالی این ژن در گیاه شاهی - Lepidium sativum - بود. تاکنون هیچ گزارشی در مورد توالی ژن FLC از گیاه مورد نظر منتشر نشده است.
شناسایی ژن FLC به عنوان ژن مهارگر گلدهی میتواند گامی مؤثر در جهت درک مکانیسمهای مربوط به گلدهی باشد. برای شناسایی قطعه ژنی مورد نظر،RNA کل از بافت تازه برگ استخراج و سنتز cDNA تک رشته ای انجام شد، از این DNA مکمل به عنوان رشته ی الگو در واکنش RT-PCR استفاده گردید. طراحی آغازگرهای اختصاصی بر اساس توالی ژنهای همساخت FLC در سایر گیاهان هم خانواده در سایت NCBI، انجام شد. نتایج نشان دهندهی تکثیر قطعهی مورد نظر از ژن به طول 361 نوکلئوتید بود که LsFLC نام گذاری شد و در پایگاه NCBI ثبت گردید.
-1مقدمه :
تولید مثل موفق گیاهان گلدار بستگی به توانایی آنها در نمو گل دارد. در طی دورههای مختلف رشد یک گیاه، گذر از فاز رویشی به فاز زایشی یکی از مهمترین مراحل است که به آن گذر به گلدهی میگویند.[22] زمان شروع گلدهی، برای یک تولید مثل موفق حیاتی است.[20] در بسیاری از گیاهان تعیین زمان گذر به گلدهی به عهده ی اثر متقابل بین برنامه های نموی و مسیرهای پاسخگو به عوامل محیطی مانند طول روز و دما است
گذر نموی به گل توسط سیگنالهای درونی و محیطی بوسیلهی مسیرهای ژنتیکی چندگانه زمانبندی میشود . حداقل پنج مسیر ژنتیکی، زمان گلدهی را در آرابیدوپسیس تنظیم میکنند : ورنالیزاسیون، فتوپریود،جیبرلین ،خودگردان و دمای محیط
درگونه گیاهی آرابیدوپسیس حدود 180 ژن دخیل در گلدهی شناسایی شده است .[10] سه ژن میانجی گلدهی به نامهای FT، FD، SOC1 - AGL20 - ، ژن های تعیین هویت مریستم گل رافعال میکنند و اعتقاد براین است که تمامی مسیرهای موثر بر گلدهی از طریق این سه ژن در گلدهی اثر میگذارند.[10] سرکوب این میانجیهای گلدهی، اغلب از طریق افزایش فعالیت پروتئین FLC انجام میشود که خود این ژن نیز توسط فعالیت ژنFRI تحریک میشود. ژن FLC، یک پروتئین MADS-box را کد میکند که این نوع پروتئینها عضوی از خانوادهی بزرگ فاکتورهای رونویسی یافتشده در تمامی ژنومهای یوکاریوتی هستند
در آرابیدوپسیس، ورنالیزاسیون یا بهاره شدن با متیﻻسیون برخی پروتئینهای هیستونی و در نتیجه تغییر اپیژنتیکی در کروماتین FLC، سبب مهار بیان این پروتئین دخیل در گلدهی شده، در نتیجه ژنهای میانجی و فرایند گلدهی تحریک میشود.
از طرفی بهاره شدن با دمتیﻻسیون ژن های ترویج گلدهی، فعال سازی این ژنها را تسریع می کند.5 بنابراین، ژن FLC به عنوان سرکوبگر قوی گلدهی، نقشی کلیدی در کنترل زمان گلدهی دارد و مناسب پاسخ به ورنالیزاسیون میباشد
-1-1معرفی گیاه :
شاهی با نام علمی Lepidium sativum L. از راستهی Brassicales و متعلق به خانوادهی Brassicaceae میباشد .[4] جنس Lepidium با داشتن 230 گونه، یکی از بزرگترین جنسهای این خانواده را تشکیل میدهد. این جنس در نقاط مختلف ایران، 15گونه دارد .[2] گونهی Lepidium sativum L. گیاهی علفی یکساله، بدون کرک یا کمی کرک دار، با ارتفاع 30-50 سانتیمتر میباشد. گلهای این گیاه، سفید و مجتمع در گلآذینهای خوشهی طویل، گلبرگها کامل و به طول 2-3 میلیمتر، خورجینک تخم مرغی، دارای دوخانه، تک دانه و کفههایی ناوی شکل باله دار و یا فاقد آن است
گیاه شاهی در طب سنتی مصارف متنوعی دارد. برگهای خشک این گیاه به عنوان مدر، مفید در التهاب، برونشیت، روماتیسم، درد عضﻻنی و بهبود قدرت حافظه استفاده میشود.[21] بذر شاهی بهدلیل محتوای باﻻی ترکیبات فنلی به میزان زیادی دارای خاصیت آنتیاکسیدانی است.[16] بهعﻻوه مطالعاتی درمورد کاربرد بذر این گیاه به عنوان داروی مسکن، ضد اضطراب و ضد درد که ناشی از میزان باﻻی آلکالوئیدها در آن میباشد انجام شده است . [29] مصرف دانهی آن به عنوان مقوی معده، توصیه شده است.
تاکنون هیچ گزارشی در مورد توالی ژن FLC از گیاه شاهی منتشر نشده است. FLC یکی از مهارکنندگان اصلی گلدهی است که می توان بواسطه آن زمان گلدهی را در یک گونه خاص تغییر داد. شناسایی این ژن مهم در گیاه شاهی که در گروه گیاهان خانواده شببو قرار میگیرد و نیز مدل بودن اغلب گیاهان این خانواده، ما را در درک مکانیسم های مربوط به گلدهی یاری میکند.
-2 مواد و روش ها
-1-2 گیاه مورد مطالعه
بذر گیاه شاهی - - Lepidium sativum از شرکت پاکان بذراصفهان خریداری شد. بذرها در شرایط مناسب نور و دما در گلخانه در گلدانهای حاوی پرلیت کشت داده شدند. پس از گذشت تقریبا 10روز از بافت تازه ی برگ برای مطالعات مولکولی استفاده شد.
-2-2 استخراج Total RNA
RNAکل از برگهای بالغ با استفاده از کیت استخراج - Qiagene, RNeasy Plant Mini Kit, Germany - RNA طبق پروتوکل موجود در کیت استخراج شد. به منظور اطمینان از حضور و کیفیت RNA از روش الکتروفورز افقی روی ژل آگارز %1 استفاده گردید.
-3-2 ساخت Complementary DNA
ساخت cDNA با استفاده از کیت ساخت cDNA شرکت فرمنتاز - RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit - و طبق روش ذکر شده در آن انجام و در نتیجه از روی RNA، رشتهی اول cDNA تهیه گردید.cDNA حاصل از برگ بالغ بهعنوان DNA الگو برای انجام PCR استفاده شد .
-4-2 طراحی آغازگرها
در راستای شناسایی ژن و مطالعات بیان ژن اولین قدم طراحی آغازگرهای مناسب است. از آنجاکه توالی یابی ژن موردنظر در گیاه مورد مطالعه انجام نشده بود، طراحی آغازگرها براساس توالی های ژن موجود در سایر گیاهان هم جنس و هم خانواده انجام شد.
براین اساس، توالی ژن هم ساخت FLC در آرابیدوپسیس تالیانا - Accenssion no: JF318804.1 - ، آرابیدوپسیس هالری - Accession no: KC505459.1 - ، تربچه - Accession no: AB611009.1 - ، کلم - Accession no: AY273161.1 - ، کلزا - Assession no: JQ255388.1 - ، خردل سفید - - Accession no: EF542803.1، خردل هندی - - Accession no: KJ489426.1 و خردل سیاه KJ733745.1 - - Accession no:از بانک ژن - http://www.ncbi.nlm.nih.gov - NCBI گرفته شد.
توالی ها با استفاده از نرم افزار ClustalW2 همردیف شدند. براساس نقاط حفاظت شدهی موجود، آغازگرهایی با استفاده از نرمافزار Gene Runner طراحی و سپس مناسب بودن آنها به وسیلهی نرمافزار BLAST مورد بررسی قرار گرفت. ساخت آغازگرها توسط شرکت پیشگام صورت گرفت. توالی آغازگرها به شرح زیر است:
Fr-FLC<5 - CCGACAAGTTACCTTCTC-3 >
Rv-FLC<5 - TTCTGTCTTCCTGGCTCT-3 >
-5-2 واکنش PCR و تعیین توالی ژن FLC
برای انجام واکنش PCR به منظور تکثیر قطعه ژنی مورد نظراز مواد مورد نیاز PCR که از شرکت سیناکلون خریداری شده بودند استفاده شد. 17 میکرولیتر آب دوبار تقطیر، 2/5 میکرولیتر بافر، 1 میکرولیتر dNTP، 0/75میکرولیتر MgCl2 و 0/25 میکرولیتر آنزیم Taq DNA Polymerase به همراه 1/5 میکرولیتر cDNA و 1میکرولیتر از هریک از آغازگرهای پیشبرنده و برگرداننده به تیوب 0/2 میلی لیتری.
