بخشی از مقاله
چکیده
تب کیو یک بیماری مشترک بین انسان و دام با انتشار جهانی است که توسط یک ریکتزیای اجباری داخل سلولی به نام کوکسیلا بورنتی - Coxiella burnetii - ایجاد میشود. گاو، گوسفند و بز عمدهترین مخازن این بیماری بوده و ارگانیسم را از طریق شیر دفع میکنند. این مطالعه با هدف بررسی میزان شیوع کوکسیلا بورنتی در شیر خام گوسفند در شهرستان خرم آباد انجام شد. این مطالعه به صورت مقطعی- توصیفی از زمستان 1392 تا بهار1393 انجام شد. در مجموعه 72 نمونه شیر گوسفند به صورت تصادفی جمعآوری شد و از نظر حضور کوکسیلا بورنتی به روش - Nested- PCR - مورد آزمایش قرار گرفتند.
در این مطالعه، از مجموع72 نمونه شیر گوسفند، 15 نمونه - 20/83 - درصد از نظر وجود کوکسیلا بورنتی مثبت بودند. شیوع کوکسیلا بورنتی در فصول مختلف متفاوت بود. با توجه به جدول آمار توصیفی در مورد کل دادههای گردآوری شده در فصل و مناطق مختلف مشاهده شد که بیش از 79/16 درصد نمونهها منفی و حدود 20/83 درصد آنها مثبت بود. بررسی حاضر نشان داد که در این منطقه کوکسیلا بورنتی وجود دارد و شیر گوسفند میتواند یکی از منابع بالقوه تب کیو در انسان باشد.
مقدمه
تب کیو یک بیماری مشترک با گسترش جهانی است که توسط باکتری گرم منفی، میلهای، داخل سلولی اجباری، به نام کوکسیلا بورنتی ایجاد می-شود.[1] کوکسیلا بورنتی دارای دو فاز آنتی ژنی غالب ناشی از تغییرات آنتیژنی در لیپوپلی ساکارید خود میباشد. مخازن تب کیو بسیار گسترده و شامل پستانداران اهلی و وحشی، پرندگان، ماهیان، خزندگان و بندپایان میباشد .[2] بیماری در حیوانات بیشتر به شکل تحت بالینی است، اما امکان بروز نشانه بالینی به ویژه اختلالات تولید مثلی نظیر سقط، مردهزایی و ناباروری وجود دارد.
[3.4.5] دامنه میزان سقط در میش و بز متغیر، و سقط اغلب در انتهای دوره آبستنی و بدون علایم بالینی خاصی اتفاق میافتد. به دنبال عفونت، کوکسیلا بورنتی در رحم و غدد پستانی پستانداران ماده متمرکز میشود و طی زایمان طبیعی یا غیر طبیعی از طریق مایعات و پردههای جنینی و همچنین از طریق ادرار، شیر و مدفوع به محیط دفع میشود. انتقال عامل به انسان عمدتاً از طریق آئروسلهای آلوده میباشد، اما ممکن است در اثر مصرف شیر خام یا محصولات لبنی آلوده هم اتفاق افتد .[5] در شکل مزمن آندوکاردیت دیده میشود که ممکن است سالها بعد از عفونت حاد بروز نماید.
فاکتورهای میزبانی به ویژه وضعیت سیستم ایمنی، اهمیت زیادی در بروز علایم کلینیکی و عواقب بیماری تب کیو دارد. تشخیص تب کیو از طریق روشهای مستقیم و غیرمستقیم انجام میشود. روشهای مستقیم نظیر مشاهده عامل بیماری ازطریق کشت و جداسازی و یا واکنش زنجیرهایی پلیمراز در آزمایشگاههای خاص که وسایل و تجهیزات خاص دارند انجام میشود. معمولاً تحقیق بر روی بیماری تب کیو بر پایه آزمایشات سرولوژی است. روشهای سرولوژی شامل میکروآگلوتیناسیون، ثبوت کمپلمان، رادیو ایمونواسی، ایمنوفلورسانس، لیزا و ایمونوبلاتینگ میباشد.
[1.5] با توجه به شرایط آب و هوایی و شکل پرورش حیوانات در کشور، تب کیو میتواند یکی از مهمترین بیماریهای مشترک بین انسان و حیوانات محسوب شود، اما اطلاعات اندکی درباره مخازن، ناقلین و شیوع بیماری و همچنین نقش آن روی سلامتی حیوانات در کشور و به ویژه استان لرستان وجود دارد. در سالهای اخیر شیوع تب کیو در انسان، حیوانات اهلی و کنهها در برخی نقاط کشور - کرمان - مورد بررسی قرار گرفته است.[6.7.8.9.10] هدف از انجام مطالعه حاضر بررسی شیوع بیماری تب کیو در بز و تعیین عوامل تأثیرگذار بر آن بود تا با مشخص شدن یوع بیماری، انجام برنامه کنترل بیماری در جمعیت دامی در دستور کار سیاست گذاران بهداشتی قرار گیرد که این امر نیز به نوبه خود با کنترل بیماری در جمعیت انسانی همراه خواهد شد.
مواد و روشکار
این مطالعه به صورت مقطعی - توصیفی از زمستان 1392 تا بهار1393 انجام شد. در این پژوهش در مجموع 72 نمونه شیر گوسفند از 18 گله گوسفند در مناطق مختلف شهرستان خرم آباد در دو فصل زمستان و بهار مورد مطالعه قرار گرفت. تعداد 36 نمونه در فصل بهار و 36 نمونه در فصل زمستان اخذ شد. جهت نمونهگیری ابتدا سرپستانکهای هر دام با الکل %70 ضدعفونی، و پس از سانتریفوژ کردن نمونهها و حذف چربی از لایهی رویی شیر، جهت استخراج DNA از رسوب حاصل با استفاده از کیت - Gene All cell SV mini 250 p - محصول شرکت تکاپوزیست طبق دستورالعمل سازنده استفاده شد. DNA استخراج شده تا زمان انجام آزمون PCR، در فریزر -20 درجه سانتیگراد، نگهداری گردید.
به منظور ردیابی کوکسیلا بورنتی در نمونههای شیر گوسفند، از روش Berri و همکاران استفاده شد.[11] برای بررسی حضور DNA ژنومی کوکسیلا بورنتی در نمونهها، روش آزمون واکنش زنجیرهای پلیمراز آشیانه ای - Nested-PCR - به کار رفت. توالی آغازگرهای مورد استفاده برای تکثیر ژن com1 که کد کننده پروتئین غشای خارجی کوکسیلا بورنتی می باشد، بر اساس روش مطالعهی Zhang و همکاران - 1998 - و Fretzو همکاران - 2007 - بود .[12.13] برای انجام PCRدر مرحله اول، غلظت بهینه مواد به کار رفته در واکنش، در حجم نهایی 25 میکرولیتر به صورت زیر استفاده شد.
مسترمیکس آماده ساخت کشور دانمارک - - Ampliqon CO., Denmark به حجم 9 میکرولیتر، DNAنمونه مشکوک به حجم 2 میکرولیتر و 1 میکرومول از هر پرایمر - پرایمرهای - OMP1-OMP2 با غلظت 10 پیکومول و مابقی حجم را آب مقطر اضافه و سپس همه مواد به داخل یک میکروتیوب 0/2 میلی لیتری منتقل و پس از مخلوط کردن در دستگاه ترموسایکلر - Applied Bioscience, USA - قرار داده شد. برنامه دمایی به صورت 94 درجه سانتیگراد 3 دقیقه، 30 چرخه دمایی به ترتیب 94 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، 56 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه و 72 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه بود و در ادامه مرحله نهایی 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه تنظیم گردید. جهت جلوگیری از نمونههای مثبت کاذب تمام مراحل ساخت مسترمیکس در زیر هود بیولوژیک انجام شد.
برای PCR مرحله دوم از پرایمرهای OMP3 و OMP4 استفاده شد. در این مرحله همه شرایط از قبیل مخلوط واکنش گرهای PCRو برنامه زمانی و دمایی مطابق مرحله اول اجرا شد. محصولات PCR حاصل از واکنش مرحله دوم در ژل آگارز %1 حاوی اتیدیوم بروماید الکتروفورز گردید و با دستگاه تصویربرداری از ژل - UVitec, UK - مشاهده و بررسی شد. طول قطعات DNA تکثیر یافته به روش PCR مربوط به جفت پرایمرهای OMP3-OMP4,OMP1-OMP2 به ترتیب 501 و 438 جفت باز است - جدول 1 را ببینید - .
در این بررسی، کنترل مثبت DNA ژنومی کوکسیلا بورنتی استاندارد از کیت تشخیصی تجاری - K047, Genekam Biotechnology AG, Germany - و کنترل منفی شامل مخلوط کلیه واکنشگرهای PCR بدون حضور DNA در نظر گرفته شد که در آن به جای DNA، آب مقطر استریل به لولهها اضافه گردید. دادههای حاصل به کمک نرمافزار SPSS مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. تحلیل آماری با استفاده از روش خیدو انجام شد.
نتایج و بحث
نتایج بررسی الکتروفورز محصولات مرحله دوم PCR در ژل آگاروز، نشان داد، از مجموع 72 نمونه شیر گوسفند، 15 نمونه از نظر وجود توالی اختصاصی ژن com1 در کوکسیلا بورنتی، مثبت بودند. در نمونههای مثبت باند 438 جفت بازی مشاهده شد - شکل . - 1 با توجه به جدول آمار توصیفی در مورد کل دادههای گردآوری شده در فصل بهار و زمستان و مناطق مختلف مشاهده شد که بیش از 20/83 درصد نمونهها مثبت و حدود 79/16 درصد آنها منفی می باشند.
