بخشی از مقاله
*** این فایل شامل تعدادی فرمول می باشد و در سایت قابل نمایش نیست ***
مهار آنزیم تیروزیناز توسط عصارهی هگزانی ده گونهی گیاهی غربالگری شده از فلور مرکزی استان کردستان
چکیده
آنزیم تیروزیناز (EC.1.14.18.1) یک متالوآنزیم است که برای فعالیتش به اتم مس و مولکول اکسیژن نیاز دارد. عملکرد این آنزیم در سلولهای اپیدرمی جانوران سبب ایجاد رنگ پوست، مو و چشمها میشود و در گیاهان نقش دفاعی علیه پاتوژنها و حشرات را بر عهده دارد و در حشرات نیز در فرآیندهای پوستاندازی و اسکلتسازی نقش دارد. فعالیت زیاد این آنزیم در پستانداران سبب ایجاد بیماریهای پوستی و در میوه و سبزیها نیز سبب سیاه شدن آنها در مجاورت هوا میشود که این امر منجر به کاهش کیفیت مواد غذایی میگردد. به همین علت مهار آنزیم تیروزیناز میتواند مانع بروز چنین مشکلاتی شود. از طرفی گیاهان و عصاره آنها منبع غنی و ارزانی از ترکیبات فعال هستند که میتوان از آنها برای مهار تیروزیناز و درمان بیماریهای پوستی وابسته به تجمع رنگدانه ملانین استفاده کرد. در این پژوهش جهت یافتن فعالیت مهارکنندگی تیروزیناز در محصولات طبیعی، از 70 گیاه بومی مناطق مرکزی استان کردستان استفاده شده و اثر مهاری عصارهی هگزانی قسمتهای هوایی گیاهان بر روی فعالیت تیروزیناز آزمایش شدند. همه عصارهها برای فعالیت مهاری تیروزیناز در چهار غلظت 0/001 ،0/01، 0/1 و 1 میکروگرم در میلیلیتر مورد سنجش قرار گرفتند. روش سنجش براساس مطالعات اسپکتروفتومتری با استفاده از میکروپلیت و قرائت جذب در طول موج 492 nm بود. در میان عصارههای هگزانی سنجش شده، تنها 10 عصارهی گیاهی فعالیت مهاری بالای 50 درصد را نشان دادند، که در این میان عصاره گیاه کنگر با نام علمی Gundelia Tourneforti(L.)، درصد مهار قابل توجهی (%75/92) را نشان داد و در عین حال IC50 آن 0/173µg/ml بود. همچنین نوع مهار آن بر اساس محاسبات سنتیکی و رسم نمودار لینویوربرک، در چهار غلظت ذکر شده به ترتیب به صورت مرکب، رقابتی، غیررقابتی، نارقابتی بود. به نظر میرسد، عصارهی گیاهانی که بیشترین تاثیر را دارند، به خصوص گیاه Gundelia Tourneforti(L.)، میتوانند موضوع تحقیقات بیشتری با هدف بدست آوردن مهارکنندههای تیروزیناز جدید با کاربردهای وسیع درمانی و آرایشی از جمله متوقف کردن تجمع رنگدانههای پوستی ناخواسته انسان باشند.
-1 مقدمه
پوست یک سد محافظتی عالی در برابر محیط خارجی است که به تنظیم دما، توازن مایعات، مراقبت در برابر میکروبهای مضر و محافظت در برابر نور خورشید (اشعهی ماوراءبنفش) کمک میکند. در واقع یکی از فاکتورهای محافظتی در برابر نور خورشید و اشعهی ماوراءبنفش، رنگدانهی ملانین1 است .(Shilimkar et al; 2012 pp, 2229-3701) ملانین یکی از بیشترین رنگدانههای موجود در باکتریها، قارچها، گیاهان و جانوران میباشد که یک بیوپلیمر2 سیاه رنگ میباشد .(Chang et al; 2012 pp,1-2) این رنگدانه در جانوران از لایه بازال3، 10 درصد از سلولهای اپیدرمی شامل؛ سلولهای ملانوسیتی پوست، فولیکول مو، مشیمیه چشم و اپیتلیوم چشم ترشح میشود که میزان بیان این رنگدانه در سلولهای مختلف، متفاوت است Tief et al; 1996 pp, 12-16) و ( Momtaz et al; .2008 pp, 507-51 اگر چه رنگ پوست و موی پستانداران توسط عوامل مختلفی از جمله: کارتنوئیدها4، هموگلوبین5، اکسی هموگلوبین6 و ملانین تعیین میشود، با این وجود مهمترین آنها میزان و نحوه پراکندگی تولید ملانین است ( Moon et al; 2010 pp, .(41 به طور کلی دو نوع ملانین در پستانداران وجود دارد، اوملانین7 و فئوملانین 8 که هر دو نوع به واسطه ترکیبی از واکنشهای آنزیمی و شیمیایی به وجود میآیند Mapunya et al; 2012 pp, 1-6) و .( Roy et al; 2013 pp, 97 دو مرحله اول مسیر بیوسنتز ملانین شامل هیدروکسیلاسیون مونوفنول به ئو - دی فنول9 (فعالیت مونوفنلازی یا کرزولازی) و اکسیداسیون ئو- دی فنول به ئو-کوینون)10فعالیت دی فنلازی یا کته کولازی) با استفاده از اکسیژن مولکولی و به کمک آنزیم تیروزیناز صورت میگیرد ( Halaban et al; 2002 pp,14821-14828 و .(Sato et al; 2009 pp, 4425-4432 این مسیر به وسیله واکنشهای غیر آنزیمی تا سنتز ملانین ادامه مییابد. خیلی از بیماریهای پوستی نتیجه سطح بالای عمل تولید رنگدانههای پوستی میباشند. تولید غیر عادی ملانین در انسان همراه با مشکلات جدی زیبایی است. برخی از بیماریهای پوستی ناشی از افزایش سطح پیگمنتاسیون11 اپیدرمی هستند، از جمله این بیماریها میتوان به ملازما12، لکههای پوستی و اگزما اشاره کرد Souza et al; 2012 pp, 48589) و .(Kamaraj et al; 2013 pp, 2013
همانطور که گفته شد، سنتز ملانین در گیاهان، میکرواورگانیسمها، قارچها، جانوران و پستانداران، برعهده آنزیم تیروزیناز است ( Tief et al; 1996 pp, 12-16 و .(Lima et al; 2013 pp, 1-7 تیروزیناز به طور گسترده در گیاهان و جانوران وجود دارد و در تشکیل رنگدانههای ملانین نقش دارد. تیروزیناز بر روی ترکیبات فنولی عمل میکند و سبب تشکیل کینونها13 میشود، مسئول رنگی شدن آنزیمی میوهها و سبزیجات میباشد. تیروزیناز در عملکردهای دفاعی در مقابل حشرات نیز نقش مهمی را ایفا میکند. فعالیت بالای تیروزیناز در گیاهان سبب ایجاد لکههای قهوهای میشود؛ لذا در صنایع غذایی، در کنترل کیفی و اقتصادی میوهها و سبزیجات
3
نقش مهمی را ایفا میکند. این آنزیم در تولید ملانین، التیام زخمها، اسکلتسازی و پوستاندازی حشرات شرکت دارد ( Kim et al; 2013 pp, 117 و .(Shilimkar et al; 2012 pp, 2229-3701 به همین علت از مهارکنندههای تیروزیناز به عنوان یک راهحل در کنترل آفت استفاده میشود. علاوه بر این از مهار کنندههای آنزیم تیروزیناز در صنایع آرایشی، دارویی و پزشکی برای جلوگیری یا درمان مشکلات پیگمنتاسیون بهره میگیرند Kamkean et al; 2007 pp, 15-19) و .(Macrini et al; 2009 pp, 715-721
در حال حاضر یکی از مهمترین مهارکنندههای شناخته شده تیروزیناز کوجیک اسید1 میباشد که یک متابولیت قارچی تولید تولید شده توسط تعدادی از گونههای آسپرژیلوس2 و پنیسیلیوم3 است و از طریق شلاته کردن 4 مس در جایگاه فعال، میتواند آنزیم را را مهار کند. گیاهان و عصارهی آنها نیز منابعی غنی از ترکیبات مهار کننده آنزیمها بهطور عام و تیروزیناز بهطور خاص میباشند. مطابق شواهد موجود در گذشته نیز از گیاهان به طور سنتی علیه بیماریهای پوستی و برای روشن شدن پوست استفاده شده است .(Souza et al; 2012 pp, 48589) از یک سو در صنایع آرایشی استفاده از مهارکنندههای تیروزیناز اهمیت زیادی دارد و از سوی دیگر گیاهان و عصارهی آنها منابعی غنی از ترکیبات مهار کننده آنزیمها و از جمله تیروزیناز هستند که میتوان از آنها در درمان بیماریهای پوستی استفاده نمود .(Souza et al; 2012 pp, 48589) با این وجود ترکیبات مهارکننده نه تنها باید سنتز ملانین را در ملانوزومها با کاهش فعالیت تیروزیناز مهار کنند بلکه از طرف دیگر نیز نباید سمی بوده و یا خاصیت جهشزایی داشته باشند. در نتیجه استفاده از گیاهان برای یافتن مهارکننده به تحقیقات بیشتری نیاز دارد. تاکنون تحقیقات گستردهای در سرتا سر جهان برای یافتن مهارکنندههای جدید صورت گرفته است. هدف کلی از اجرای این پروژه شناسایی تعدادی از گیاهان استان کردستان به منظور یافتن گونههایی است که عصاره هگزانی آنها توانایی مهار آنزیم تیروزیناز را داشته باشند. بدین منظور هفتاد گونهی گیاهی از مناطق مختلف کردستان جمعآوری و شناسایی شد. پس از عصارهگیری در حلال هگزان، از لحاظ توانایی مهار آنزیم مورد بررسی قرار گرفتند.
-2 مواد و روشها
-1-2 مواد
عصارهی هگزانی گیاهان جمعآوری شده، آربوتین (مهارکنندهی استاندارد خریداری شده از شرکت سیگما)، آنزیم تیروزیناز قارچی 25kU (خریداری شده از شرکت سیگما)، ال- دوپا (سوبسترای خریداری شده از شرکت سیگما)، ان-هگزان ( خریداری شده از شرکت مرک)، DMSO (دی متیل سولفوکساید خریداری شده از شرکت مرک)، KH2PO4 وK2HPO4.3H2O (نمکهای خریداری شده از شرکت مرک برای تهیه بافر فسفات 50 میلیمولار، (PH=6/5، HCL و KOH (خریداری شده از شرکت مرک)، دستگاه روتاری اواپراتور((Heidolph Hei-VAP Value، دستگاه میکروپلیتریدر(Tecan مدل (Sunrise، آسیاب خانگی مولینکس.
4
-2-2 روش کار
70 گونهی گیاهی مورد استفاده در پژوهش پس از جمعآوری از مناطق مختلف کردستان توسط مهندس حسین معروفی کارشناس ارشد سیستماتیک گیاهی مرکز تحقیقات کشاورزی سنندج شناسایی و در هرباریوم این مرکز دارای سند می باشند. پس از شناسایی، گیاهان تمیز و بر روی کاغذهای کاهی قرار داده میشدند تا در محیط دور از نور آفتاب و دمای اتاق خشک شوند. گیاهان خشک شده ابتدا از لحاظ آلودگی به خاک و یا سایر گیاهان بررسی و سپس توسط آسیاب خانگی مولینکس پودر میشدند. براساس نوع گیاه و حجم پودر مقداری از پودر تهیه شده، توزین و به ظرفهای تیره تمیز منتقل میشد. به ظرفهای تیره حاوی نمونه، مقدار معینی هگزان اضافه میشد و پس از 24 ساعت محتویات ظرف تیره از کاغذ صافی واتمن شماره 42 عبور داده میشد. مایع صاف شده توسط دستگاه روتاری با دمای 68 درجه سانتیگراد با 50 دور در دقیقه، تغلیظ میشد. عصاره تغلیظ شده جهت خشک شدن کامل، روی شیشه ساعت بزرگ پخش و پس از خشک شدن در هوا، عصاره خشک شده جمعآوری و درون میکروتیوب ریخته شد. فعالیت آنزیم در حضور عصاره با روش اسپکتروسکوپی بررسی میشد و درصد مهار آنزیم بوسیله نرمافزار Excel محاسبه میشد. در نهایت نوع مهار برای موارد دارای مهار قابل توجه نیز تعیین میشد.
-3-2 سنجش اثرات مهاری عصارههای هگزانی بر روی آنزیم با استفاده از دستگاه میکروپلیتریدر
در این پژوهش از روش خطیب، به همراه یکسری تغییرات استفاده شد .(Souza et al; 2012 pp, 48589) سنجشها در میکروپلیت-های 96 چاهکی با استفاده از دستگاه میکروپلیتریدر انجام میشد. در ابتدا جذب میکروپلیت خالی اندازهگیری میشد. برای هر کدام از عصارهها یک چاهک تست و یک چاهک بلانک در نظر گرفته میشد.
چاهک بلانک حاوی تمام اجزاء تست به غیر از آنزیم بود. سنجشها برای هر عصاره در چهار غلظت و هر غلظت سه تکرار انجام میشد. برای سنجش فعالیت مهارکنندگی عصاره، بعد از اندازهگیری جذب میکروپلیت خالی، در چاهکها بافر ریخته میشد تا شرایط مورد نیاز برای فعالیت آنزیم به وجود آید. سپس به ترتیب آنزیم و عصاره هگزانی اضافه میشدند و میکروپلیت به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه میشد. پس از آن سوبسترا (ال- دوپا)، به وسیله سمپلر 12 کاناله به چاهکها اضافه میشد. میکروپلیت پس از 20 دقیقه انکوبه شدن دردمای اتاق برای خواندن جذب به مدت 10 دقیقه در دستگاه قرار میگرفت. جذب میکروپلیت پس از هر 2 ثانیه همزدن، با فواصل 1 دقیقهای در طول موج 492 نانومتر ثبت میشد. جذب میکروپلیت خالی و چاهک بلانک از جذب تست کسر میشد تا در نهایت جذب نهایی فقط در نتیجهی فعالیت آنزیم باشد. برای کنترل مثبت از آربوتین استفاده میشد. در چاهک تست کنترل مثبت به جای عصاره از آربوتین و در چاهک تست کنترل منفی به جای عصاره از بافر استفاده میشد (جدول.(1
5
جدول 1 محتویات چاهکهای آزمایش در میکروپلیت
-4-2 روش محاسبات
همانطور که گفته شد جذب پلیت خالی از جذب چاهکهای تست متناظرش کسر میشد و جذب نهایی با تفریق جذب چاهک بلانک از جذب چاهک تست محاسبه میشد. با رسم نمودار جذب نهایی عصاره بر علیه زمان شیب نمودار بدست میآمد. شیب نمودار کنترل منفی نیز به همین ترتیب رسم میشد. با استفاده ازمعادله 1-2 و مقایسه شیب نمودار کنترل منفی و تست درصد مهار آنزیم تیروزیناز بدست میآمد. انحراف استاندارد نیز برای هر مهار محاسبه میشد. تمام مراحل برای چهار غلظت عصاره انجام میشد و درصد مهار برای سه تکرار هر غلظت محاسبه میشد و در نهایت میانگین گرفته میشد تا درصد مهار برای هر غلظت بدست آید. همچنین برای عصارههایی با درصد مهار بالا، IC50 تعیین میشد که ازطریق رسم نمودار درصد مهار بر علیه لگاریتم غلظت عصاره بدست میآید.
معادله ×100 (1-2) = درصد مهار
-5-2 بررسی سنتیکی آنزیم تیروزیناز در حضور عصارهی گیاهی با بالاترین درصد مهار
برای تعیین نوع مهار و محاسبهی پارامترهای سینتیکی Km، Kmapp، Vm، Vmapp و Ki برای آنزیم تیروزیناز، در حضور عصارهی گیاهی و بدون حضور عصاره (کنترل) نمودار لاینویور- برک در چهار غلظت متفاوت سوبسترا رسم شد. غلظتهای سوبسترا بر اساس ضرایب پیشنهادی برای نمودار لاینویور-برک انتخاب شدند و شامل چهار غلظت 5، 2، 1/33، 1 میکروگرم بر میلیلیتر بود. سنجش فعالیت آنزیم برای هر عصاره در چهار غلظت و هر غلظت سه تکرار انجام شد و جذب در طول موج 492 نانومتر قرائت شد. در نهایت تمام محاسبات با استفاده از معادلهی خط نمودار لینویور-برک در نرمافزار Excel محاسبه شد.
-3 نتایج
-1-3 نتایج سنجش اثرات مهاری عصارههای هگزانی بر روی آنزیم تیروزیناز قارچی
براساس درصد فعالیت مهارکنندگی،70 عصارهی هگزانی به سه گروه شامل مهارکنندهی قوی، متوسط و ضعیف تقسیم شدند. در میان عصارههای هگزانی مورد مطالعه، 10عصاره؛ یعنی 14/28 درصد با فعالیت مهارکنندگی بالای %50 به عنوان مهارکنندههای قوی تیروزیناز شناخته شدند (شکل.(1 سایر عصارهها با فراوانی %67/14، مهارکنندگی بین15-50 درصد و 18/57 %، مهارکنندگی پایینتر از15 درصد بهترتیب به عنوان مهارکنندههای متوسط و ضعیف شناخته شدند.
-2-3 نتایج تعیین IC50
از طریق رسم نمودار درصد مهار برعلیه لگاریتم غلظت عصاره، IC50 عصارههای هگزانی دارای درصد مهار بالا محاسبه شدند (جدول.(2
