بخشی از مقاله
چکیده
یکی از راههای مفید برای کاهش جذب گلوکز مهار آنزیمهای هیدرولیزکنندهی کربوهیدراتها است. هدف تعیین میزان مهارکنندگی آلفاگلوکوزیداز توسط عصاره هگزانی اندامهای هوایی مجزای گیاهان خاکشیر - Descurainia Sophia - و شاهتره - Fumaria vaillantii - بود. فعالیت آنزیم در 405 نانومتر با سنجش میزان پارانیتروفنل آزاد شده از پارانیتروفنیل-آلفا- دی گلوکوپیرانوزید بررسی شد. عصاره هگزانی اندامهای گل خاکشیر و برگ شاهتره در غلظت 200 میلیگرم بر میلی-لیتر فعالیت مهارکنندگی %100 داشتند. میزان IC50 آنها به ترتیب برابر 0/88 و 1/04 میلیگرم بر میلیلیتر بود. الگوی مهار برای عصاره گلِ خاکشیر، مختلط - رقابتی- غیررقابتی - و برای عصاره برگ گیاه شاهتره، نارقابتی بود.
مقدمه و هدف
بیماری دیابت، در واقع به مجموعه اختلالاتی گفته میشود که با عدم تنظیم یا تنظیم ناقص در مسیرهای متابولیسمی کربوهیدراتها، پروتئینها و لیپیدها همراه است.همچنین دیابت میتواند یک اختلال در تولید انسولین، عمل انسولین یا هر دو باشد.[
اختلال در ترشح انسولین باعث افزایش در سطح گلوکز خون میشود که این افزایش قند خون میتواند منجر به عوارض میکروواسکولار مانند اختلال بینایی، نارسایی مزمن کلیه و تخریب اعصاب محیطی شود. دیابت همچنین با بیماریهای ماکروواسکولار به خصوص بیماری عروق کرونر قلب مرتبط میباشد. بنابراین دیابت یک مشکل بهداشتی در حال رشد در سراسر جهان میباشد و باعث عوارض شدید و پرهزینه از جمله کوری، بیماریهای قلبی و کلیوی میشود. تعداد کل افراد دیابتی در سراسر جهان در سال 2000، 171 میلیون نفر بوده و پیشبینی میشود که این رقم تا سال 2030 به 366 میلیون نفر برسد.
در حال حاضر شیوع دیابت در میان بزرگسالان 7/7 درصد بوده است و پیشبینی میشود این رقم تا سال 2030 به 69 درصد برسد.دیابت نوع I به دلیل سنتز ناکافی انسولین توسط سلولهای بتای پانکراس و دیابت نوع II به دلیل مقاومت در برابر انسولین یا اختلال عملکرد در سلولهای بتای پانکراس روی می-دهند.
سرکوب کنندههای اشتها، مهارکنندههای هضم، محرکهای ترشح انسولین و القای انسولین مصرف گلوکز را تحریک میکنند و با مهار کردن گلوکونئوژنز و گلیکوژنولیز باعث به تعادل رسیدن سطح گلوکز خون میشوند. یکی از مفیدترین روشها برای کاهش جذب گلوکز، از طریق مهار آنزیمهای هیدرولیزکنندهی کربوهیدراتها مانند آلفا آمیلاز و آلفا گلوکوزیداز بوده است.
آنزیم آلفا گلوکوزیداز - EC 3.2.1.20 - یک آنزیم کلیدی در هضم کربوهیدراتها در انسان می-باشد که باعث هیدرولیز پلیساکاریدها میشود. روند هیدرولیز کربوهیدراتها توسط این آنزیم به این صورت است که کربوهیدراتها - الیگوساکاریدها و دیساکاریدها - در رودهی کوچک به آنزیم آلفا گلوکوزیداز متصل و با فعالیتهای این آنزیم به واحدهای کوچکتر - مونوساکاریدها - تجزیه میشوند.[7] کنترل سطح گلوکز خون پس از صرف غذا میتواند یک فاکتور مهم برای درمان دیابت باشد. یکی از روشهای کاهش هایپرگلیسمی پس از غذا تاخیر در جذب مونوساکاریدها میباشد.
بنابراین امروزه استفاده از مهارکنندههای آنزیم آلفا گلوکوزیداز نقش بسزایی در درمان دیابت دارند. این مهارکنندهها باعث تأخیر عمل آنزیم آلفاگلوکوزیداز برای شکستن کربوهیدراتهای پیچیده به قندهای ساده میشوند. بنابراین ورود گلوکز به خون را کاهش میدهند.
در گذشته از داروهای ضددیابتی زیادی مانند آکاربوز، ووگلیبوز و میگلیتول برای درمان دیابت استفاده شده است اما این داروها باعث اثرات جانبی متعددی مانند سمیت کبدی، درد شکم، نفخ شکم، اسهال و هیپوگلیسمی شدید میشوند همچنین پس از درمان طولانی مدت با این داروها، مقاومت انسولین در برابر این داروها گزارش شده است.
تئوری و پیشینه تحقیق
گزارشات اخیر نشان داده است که 80 درصد از جمعیت جهان از گیاهان دارویی و مشتقات آنها برای درمان و مدیریت بیماریهای مختلف از جمله دیابت شیرین استفاده میکنند. با توجه به اثرات جانبی که داروهای شیمیایی دارند، کشف داروهایی که دارای عوارض جانبی کمتر و اثر سریعتر باشند میتواند بسیار مفید باشد. در حال حاضر به عصارههای طبیعی که از گیاهان به دست میآید و میتوانند آنزیم آلفا گلوکوزیداز را مهار کنند، توجه زیادی میشود.
مطابق نتایج یک آزمایش غربالگری برای فعالیت آنزیم آلفاگلوکوزیداز در میان عصاره هگزانی 60 گونه گیاهی بومی استان کردستان، هفت گیاه دارای فعالیت مهاری بالا معرفی شدند که دو گیاه خاکشیر و شاهتره از آن جملهاند با توجه به اینکه در مطالعات قبلی اثر مهاری گیاه خاکشیر و شاهتره روی آنزیم آلفا گلوکوزیداز بررسی و اثر مهاری آنها گزارش شده بود ، ضروری است برای به دست آوردن عصاره خالصتر با خاصیت مهارکنندگی قویتر، اندامها و بخشهای مختلف گیاهان از نظر توانایی خاصیت مهارکنندگی مورد بررسی قرار گیرند، بنابراین یافتن اندامی از گیاه که درصد مهار بالایی دارد،احتمالاً می-تواند به یافتن ماده مؤثر کمک نماید. هدف از مطالعه حاضر بررسی اندامها و بخشهای مختلف هوایی گیاهان دسکورینیا سوفیا - نام فارسی: خاکشیر - و فوماریاویلانتی - نام فارسی: شاهتره - از نظر توانایی مهار کردن آنزیم آلفاگلوکوزیداز با هدف یافتن اندام حاوی ماده مؤثر میباشد.
مواد و روشها
مواد شیمیایی و بیوشیمیایی
آنزیم آلفا گلوکوزیداز ساکارومایسس سرویزیه، سوبسترای پارانیترو فنیل آلفا دی گلوکو پیرانوزید - pNPG - ، آکاربوز - مهارکننده استاندارد آنزیم آلفا گلوکوزیداز - ، آلبومین سرم گاوی - BSA - که از شرکت سیگما- آلدریچ - Sigma- Aldrich - خریداری شدند، حلال ان- هگزان و DMSO - دی متیل سولفوکساید - از شرکت مرک - Merch - آلمان تهیه شدند.
نمونه های گیاهی
اندامهای هوایی گیاهان خاکشیر و شاهتره در ماههای اردیبهشت و خرداد از مناطق مختلف استان کردستان توسط آقای مهندس معروفی کارشناس ارشد سیستماتیک گیاهی جمعآوری و به مرکز تحقیقات کشاورزی استان کردستان ارسال شد. پس از شناسایی و رده بندی، اندامهای مختلف - شامل گل، برگ و ساقه - به طور کامل جداسازی شده و بلافاصله به محل نگهداری آزمایشگاه تحقیقاتی گروه علوم زیستی منتقل شد.
اندامهای هوایی گیاه جمعآوری شده در سایه و دمای محیط آزمایشگاه خشک شدند و قبل از تهیهی پودر از نمونهها، آنها از لحاظ نظافت و عدم آلودگی بررسی شدند سپس به وسیله قیچی باغبانی به قطعات کوچکی خرد شدند و بوسیله آسیاب خانگی مولینکس به صورت پودر نرم درآورده شدند.پودرهای به دست آمده از اندامهای هوایی گیاه پس از توزین در ظروف دربدار پلاستیکی تا زمان عصارهگیری، در دمای اتاق نگهداری شدند.
تهیه ی عصاره هگزانی
به منظور تهیهی عصاره هگزانی، 40 گرم پودر تهیه شده از هر یک از اندامهای هوایی گیاه در 200 میلیلیتر حلال ان- هگزان به مدت 24 ساعت خیسانده شد در این مدت به فواصلی همزده میشدند. پس از زمان طی شده مخلوط حلال و پودر توسط کاغذ صافی واتمن شماره 42 صاف شد. مایع صاف شده توسط دستگاه روتاری اواپریتور در دمای 65 درجه سانتیگراد تغلیظ شده و پس از تخلیه از مخزن دستگاه، جهت خشک شدن کامل، روی شیشه ساعت به قطر 15 سانتیمتر، پخش شده و در زیر هود شیمیایی و در دمای محیط قرار گرفت. عصارههای خشک شده از روی سطح شیشه ساعت جمع-آوری و در میکروتیوب 1/5 میلیلیتری تا زمان انجام مراحل بعدی در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری شدند. جهت افزایش حلالیت عصارههای هگزانی در بافر از دیمتیلسولفوکساید استفاده شد. بدین منظور 1500 میلیگرم از عصاره گیاهی در 1 میلیلیتر دیمتیلسولفواکساید حل شد. از این محلول به عنوان استوک در مراحل بعدی استفاده شد.
سنجش مهار فعالیت آنزیمی
در این مطالعه جهت سنجش قدرت مهارکنندگی عصارههای اندامهای هوایی گیاه بر روی فعالیت آنزیم آلفاگلوکوزیداز، از روش اصلاح شدهی پیستیا- براگمن با مختصر تغییراتی استفاده شد.[11] سنجشها در میکروپلیتهای 96 چاهکی و در حجم کل 150 میکرولیتر و با استفاده از دستگاه میکروپلیتخوان تکن مدل سانرایز1 به ترتیب زیر انجام شد. 50 میکرولیتر بافر فسفات، 20 میکرولیتر از عصاره محلول در ان-هگزان و 10 میکرولیتر آنزیم آلفاگلوکوزیداز ساکارومایسس سرویزیه 1U/ml - محلول در بافر فسفات - وارد چاهک شده، به منظور مخلوط شدن این اجزا با هم میکروپلیت در درون دستگاه به مدت 3 ثانیه مرتعش شد.
پس از 5 دقیقه انکوبه کردن در دمای 37 درجه سانتی گراد، برای شروع واکنش 20 میکرولیتر سوبسترا به مخلوط فوق اضافه شد. آنگاه پس از 30 دقیقه انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد، جهت توقف واکنش، 50 میکرولیتر سدیم هیدروکسید - NaOH - به آن اضافه شد. سپس میکروپلیت در داخل دستگاه میکروپلیت قرار گرفته و پس از 3 ثانیه همزدن، جذب آن به مدت 3 دقیقه و هر یک دقیقه یکبار در طول موج 405 نانومتر اندازهگیری شد. چاهک بلانک حاوی تمام مواد به غیر از آنزیم بود. همچنین برای تمام سنجشها کنترل مثبت و منفی استفاده شد.
در چاهک کنترل مثبت به جای عصاره از آکاربوز و در چاهک کنترل منفی به جای عصاره از بافر فسفات استفاده شد. پس از پایان سنجش، جذب پلیت خالی از جذب چاهکهای متناظرش کسر شده و سپس با تفریق جذب چاهک بلانک از جذب چاهک تست، جذب نهایی محاسبه شد. سرعت واکنش براساس شیب نمودار جذب علیه زمان محاسبه شد.
درصد مهار برای سه تکرار هر عصاره محاسبه و در پایان میانگین گرفته شده و انحراف استاندارد محاسبه شد. تمام مراحل گفته شده برای 7 غلظت - در غلظتهای 200، 100، 10، 1، 0/1، 0/01 و 0/001 میلیگرم بر میلیلیتر - مختلف عصاره انجام شده و میانگین درصد مهار به دست آمد. از طریق رسم نمودار درصد مهار بر علیه غلظت نهایی عصاره، IC50 که بیان کننده مقدار غلظتی از عصارهها است که 50 درصد مهار میدهد، تعیین شد.
به منظور تعیین نوع مهار اعمال شده توسط عصارههای دارای بیشترین درصد مهار نمودار معکوس مضاعف سنتیکی لینویور- برک براساس واکنش آنزیمی در حضور غلظتهای مختلف عصاره و بدون حضور عصاره - کنترل - در شش غلظت مختلف سوبسترا رسم شد. غلظتهای تهیه شده سوبسترا براساس ضرایب نمودار لینویور- برک انتخاب، و در شش غلظت 0/311، 0/622، 1/24، 1/87، 2/49 و 3/11 میلیمولار تهیه شد
