بخشی از مقاله
مقدمه
سرخارگل با نام علمی Echinacea purpurea گیاهی اسـت چنــد ســاله و متعلــق بــه خــانواده گــل ســتاره1 کــه بــر طبــق فارماکوپههای معتبر بهعنوان یک گیاه دارویی ارزشـمند شـناخته شده است. ترکیبات متنوعی از این گیاه بهمنظور مطالعه قابلیـت افزایش توانایی ایمنی تاکنون مورد مطالعه و بررسی قرار گرفتـه اند 1) و .(2 بهنظر میرسد که اثر ایمنی این گیاه در مرحله اولیه از طریق فعالسازی پاسخهای ایمنی ذاتی انجام گیرد. ترکیبـات این گیاه جزو متداولترین گیاهان دارویی است که امروزه مـورد اســتفاده قــرار مــیگیــرد و بــسیاری از مــوارد اســتفاده آن بــه خصوصیات ایمونولوژیک آن مربوط است. برخی از مقـالات نیـز تأیید کننده فعالیتهـای ایمونومـدولاتوری مهـم ایـن ویـروس میباشند .(3- 5) دومین خصوصیت فارماکولوژیک گزارش شـده از این گیاه، فعالسازی ماکروفاژی است که اهمیت دارویی ایـن گیاه را بیشتر نموده است .(5) بیشترین اطلاعات در مورد خواص دارویی این گیاه مربوط به آزمایشات مختلفی است کـه بـر روی اثر عصاره این گیاه در درمان عفونتهای تنفسی فوقانی بهدست آمده است .(6- 9)
در تحقیقات بررسی اثر زیستی عصاره سرخارگل مشخص شده که این عصاره سللاینها (دودمـانهـای سـلولی) را در مقابـل ویروسهایی مثـل آنفـولانزا و ویـروس ویزیکـولار اسـتوماتیت محافظت میکند کـه علـت آن احتمـالا بـهدلیـل القـای تولیـد
1 Asteraceae
مجله پژوهشی حکیم
اینترفرون در سللاینهای مورد آزمایش میباشـد. در تحقیقـات مشابه سه ترکیب فنولیک از سـرخارگل جـدا شـد کـه خاصـیت ضدویروسی در مقابل وزیکولار اسـتوماتیت داشـتند .(10) دیگـر اعضای خانواده گل ستاره هم قابلیت ضدویروسـی قـوی دارنـد .(1) ویــروس هــرپس ســیمپلکس تیــپ یــک انــسانی، عامــل ایجادکننده بیماریهای مختلف در انـدامهـای گونـاگون اسـت. بیماریهای ایجاد شده توسط این ویروس عفونی بوده و معمولاً از طریق تماس مستقیم به افراد حساس انتقال مـییابـد. هـدف این مطالعه، بررسی توانایی ضدویروسی عصاره پیکر رویشی گیاه ســرخارگل کــشت شــده در ایــران در مقابــل ویــروس هــرپس سیمپلکس تیپ یک است.
روش کار
سرخارگل بومی ایران نبوده و بذر آن بـرای اولـین بـار توسـط آقای دکتر امیدبیگی از دانشگاه بوداپست مجارستان (که در آنجا با کد EP-COM2 شناسایی شده است) در سال 1372 به ایران آورده شد و در باغ تحقیقاتی شرکت گیاهان دارویی زردبند کشت گردید. جهت تهیه عصاره این گیاه از روش خیـساندن2 اسـتفاده گردید. بدینمنظور پیکر رویشی گیاهان کـشت شـده در مزرعـه تحقیقاتی شرکت زردبنـد واقـع در منطقـه لواناسـات در مرحلـه گلدهی (شهریورماه) برداشت شد و در دمای محیط و بـه دور از
2 Maceration
امیر قائمی و همکاران
تابش نور خورشید خشک گردید. میزان 50 گرم از گیـاه خـشک شده آسیاب و درون ارلن ریخته شد. سپس مقدار 500 میلیلیتـر الکل 70 درجه به آن اضـافه گردیـد و بـه مـدت 48 سـاعت در دمای محیط آزمایشگاه قرار داده شد. طی این مدت چنـدینبـار ظرف تکان داده و بهم زده شد. پس از مـدت مـذکور محتویـات درون ارلن با کاغذ صافی صاف گردیـد. سـپس حـلال بـهروش تقطیر در خلأ و در دمای 40˚C از عصاره جدا گردیـد. بـهمنظـور تعیین وزن عصاره خشک میزان 5 میلیلیتر از محلول صاف شده درون شیشه ساعت که وزن آن با سه رقم اعشار معلوم شده بود، ریخته شد. سپس به مـدت سـه سـاعت در دمـای 105˚C قـرار گرفت تا کاملاً خشک شود. پس از خشک شدن، مجـدداً شیـشه ساعت وزن شده و اختلاف وزن آن با وزن شیشه سـاعت خـالی بهعنوان وزن عصاره خشک اندازه گرفته شد.
در این پژوهش از سلول هـایِورو1 کـه از کلیـه میمـون سـبز آفریقایی بهدست آمده است استفاده شـد. محـیط کـشت یاختـه عموماً از یک محلول نمکی تنظیم شده که حاوی انواع اسیدهای آمینه، ویتامینها و قندها میباشـد. یکـی از محـیطهـای بـسیار مناسب جهت کشت این یاخته، محیط کشت DMEM است. به محیط کشت سلولی، مقدار %5 سرم غیرفعال شده گوساله اضافه و از این محیط برای رشد و کشت یاخته استفاده شـد. اسـیدیته2
محیط کشت در حد 7/4 تنظیم شد. برای جلـوگیری از تغییـرات ناگهانی pH، از بافر کربناتسدیم و بـهمنظـور ممانعـت از رشـد میکروارگانیسمهـای احتمـالی، از مقـادیر معینـی آنتـیبیوتیـک استفاده گردید. سلولها در حضور %5 گازکربنیک در دمای 37˚C
بهشکل یک لایه سلولی3 رشد میکنند و بستر مـورد نیـاز بـرای بررسی اثر ضدویروسی عصاره تأمین میشود.
برای انجام آزمون اصلی لازم بود تا عیار ویروس تعیـین شـود که در این پـژوهش از روش TCID50 بـرای مـشخص کـردن عفونتزایی ویروس استفاده شد. نقطه پایان این ارزیابی، رقتی از سوسپانسیون ویروس میباشد که قادر است %50 از سـلولهـای سالم را آلـوده نمایـد. در ایـن روش ابتـدا رقـتهـای سـریال از سوسپانسیون ویروسی با فاصله 0/5 لگاریتم تهیه شد. برای ایـن منظور در 12 لوله آزمایش استریل 2/16 میلیلیتر محیط کـشت
DMEM فاقد سرم استریل ریخته و با استفاده از سـمپلر مقـدار یک میلیلیتر از سوسپانـسیون ویروسـی بـه لولـه آزمـایش اول اضافه و به خوبی مخلوط شد. پس از تعویض سـر سـمپلر، یـک میلیلیتر از محلول لوله آزمـایش اول برداشـته شـده و بـه لولـه
1 Vero 2 pH
3 Mono layer
61
آزمایش دوم اضافه گردید و این عمل تـا آخـرین لولـه آزمـایش ادامه یافت. بهدنبال رقتسازی متوالی به مقدار 200 میکرولیتر از هر رقت به 6 چاهک در ردیفهای مختلف در داخل یک پلیـت
96 خانهای افزوده شـد. در هـر ردیـف یـک چاهـک بـه شـاهد ویروس و یک چاهک به شاهد سلولی اختصاص داده شد. سپس میکروپلیت بهمدت یک ساعت به گرمخانه37˚C منتقل شد. آنگاه به تمام چاهکها 200 میکرولیتر محیط کشت حـاوی %5 سـرم اضافه شد و چاهکها هر روز از نظر آثار تخریب سـلولی4 مـورد بررسی قرار گرفت. نتایج عیار عفونـتزایـی بـا اسـتفاده از روش کربـــــر5 توســـــط فرمـــــول زیـــــر محاســـــبه شـــــد
