بخشی از مقاله
مقدمه
استفاده از گیاه در درمان بیماریها بهویژه بیماریهاي عفونی در سالهاي اخیر روند رو به افزونی پیدا کرده است. استفاده بیرویه از داروهاي شیمیایی جهت درمان بیماریهاي عفونی منجر به ظهور ایزولههاي مقاوم میکروبی
گردیده که هر روزه بر تعداد آنها افزوده میگردد
.(Dupont et al., 1996 ; Ayliffe et al., 1997) ظهور
سویههاي مقاوم به داروهاي شیمیایی، تلاش براي یافتن عوامل ضد میکروبی جدید را ضروري مینماید. گیاهان و ترکیبهاي آنها شامل اسانسها و عصارههاي گیاهی داراي توان بالقوه جهت جایگزینی با داروهاي شیمیایی هستند
.(Srinivasan et al., 2001) این در حالی است که
عوارض جانبی این ترکیبها در مقایسه با داروهاي شیمیایی کمتر است .(Cowan, 1999) استفاده از اسانسهاي گیاهی در صنایع دارویی، مواد غذایی، طب مکمل و درمانهاي گیاهی براساس خاصیت ضد میکروبی اسانسهاي گیاهی در مقابل ارگانیسمهاي مختلف استوار است
.(Nascimento et al., 2000; Rana et al., 1997)
از جمله گیاهان بـومی ایـران، مـیتـوان از گیـاه لعـل کوهستان نـام بـرد. جـنس Oliveria متعلـق بـه خـانواده Umbelliferae در ایران یک گونه بـا نـام O. decumbens
دارد کــه بــهطــور محلــی بــه آن "دن" یــا "دنــک" یــا
"موشکورك" میگویند و در مناطق گرمسـیري اسـتانهاي کرمانشاه، خوزستان و ایلام میروید و علاوه بـر ایـران در جنوب شرق آناتولی، سوریه و عـراق نیـز پراکنـده اسـت
(مظفریان، .(1382 در طب سنتی ایران از این گیـاه جهـت درمان سوء هاضمه، اسهال و دردهاي شکمی و رفـع تـب استفاده میشود. مطالعات مختلفی روي ترکیـب شـیمیایی اســانس حاصــل از گلهــاي گیــاه انجــام گرفتــه اســت
Sajadi & Hosseini, 2002)؛ نجـفپـور نـوایی و میـرزا،
1381؛ (Amin et al ., 2005 و تـاکنون تنهـا یـک مطالعـه روي خاصــیت ضــد میکروبــی آن انجــام شــده اســت
.(Amin et al., 2005) در آن مطالعــه، بــازده اســانس استخراج شده از گلهاي جمعآوري شده از جنوب شـیراز
%6 گزارش شده اسـت. ایـن اسـانس داراي %47 تیمـول،
%23 کارواکرول، %8/7 پاراسیمن و %18 گاما-ترپینن بـوده و اثرهاي ضد میکروبی اسانس حاصل از گلهاي گیاه لعـل کوهستان در مقابـل تعـداد محـدودي میکروارگانیسـم 3)
باکتري گرم مثبت، 3 باکتري گرم منفی، 1 قارچ رشتهاي و یک مخمر) بررسی شده است. Amin و همکاران (2005)
گزارش نمودهاند که اسانس، فعالیت ضدمیکروبی وسـیعی در مقابل همه ارگانیسمهاي مطالعه شده نشان مـیدهـد و این اثر با اثر آنتیبیوتیکهاي تجاري قابل مقایسه میباشـد.
همچنین حداقل غلظت مهارکننـده رشـد (MIC) اسـانس حاصل از گلهاي گیاه بـر باکتریهـاي گـرم مثبـت و منفـی نشان میدهد که میزان حساسیت باکتریهاي گـرم مثبـت و منفی به یک اندازه میباشد و این مقدار از حداقل غلظـت مهار کننده رشد براي قارچ و مخمـر مطالعـه شـده در آن تحقیق کوچکتر است. این بدین معنی است که باکتریها در مقایسه با قارچها نسبت به اسانس حساسترنـد. همچنـین قطر هاله عدم رشد براي باکتریهاي گـرم مثبـت و قارچهـا یکسان میباشد. بازده اسانس استخراج شده از گلهاي گیاه لعل کوهستان از منطقه کرمانشاه حدود %0/1 بـوده اسـت که داراي %28 تیمول، %29 کارواکرول، %15/4 پاراسـیمن،
%20/5 گاما-ترپینن میباشـد (نجـفپـور نـوایی و میـرزا،
.(1381 تحقیق دیگري کـه روي اسـانس لعـل کوهسـتان انجام شده نشان داده که اسـانس حاصـل از گلهـاي گیـاه داراي %37/2 تیمول، %22/1 کارواکرول، %11/8 پاراسیمن
85 مطالعه خاصیت ضد میکروبی و ترکیب شیمیایی...
و %12/8 گاما-ترپینن است .(Sajadi & Hosseini, 2002)
باتوجه به مطالعات فوق، ترکیبهـاي شـیمیایی و اثـر ضـد میکروبی اسانس حاصل از اندام هوایی گیاه لعل کوهستان بر 18 میکروارگانیسـم مختلـف بررسـی گردیـد و نتـایج بدست آمده با مطالعات گذشته مقایسه گردید.
مواد و روشها
شناسایی و جمعآوري گیاه
اندامهاي هوایی گیاه لعل کوهسـتان (در مرحلـه کامـل گلدهی) در اردیبهشت ماه سال 1386 از منطقه کازرون در استان فارس جمعآوري گردید. پس از خشک کردن گیـاه در سایه و خـرد کـردن آن بـه قطعـات کوچـک، از انـدام هوایی گیاه به روش تقطیر با آب بـه مـدت 6 سـاعت بـا دستگاه کلـونجر (Clevenger apparatus) اسـانسگیـري بهعمل آمـد و پـس از جداسـازي اسـانس از سـطح آب، توسط سولفات سدیم آبگیري و در شیشههاي تیره و در بسته نگهداري شد. مقدار3/4 میلـی لیتـر اسـانس بـه ازاي
100 گرم وزن خشک گیاه حاصل شد .(%3/4V/W)
تجزیه اسانس لعل کوهستان
نظر به این که در مراجع Sajadi & Hosseini, 2002)؛
نجفپور نوایی و میرزا 1381؛ (Amin et al ., 2005 اجزاء اسانس این گیاه بوسیله GC/MS شناسـایی شـده بـود، در ایـن تحقیـق، اجـزاي عمـده اسـانس بـا اسـتفاده از GC
جداسازي و با روش نرمالیزاسیون، درصـد آنهـا مشـخص گردیــد. آنــالیز اســانس بــا اســتفاده از دســتگاه گــاز کروماتوگراف، الگوي Varian CP-3800 طبق شرایط زیر انجام شد. ستون مورد استفاده CP Sil 8CB بـه طـول 60
متر و قطر 0/32 میلیمتر، ضخامت لایـه فـاز سـاکن 0/25
میکرومتر، گاز حامل نیتروژن و فشار گاز سر ستون 7 psi
بود. برنامهریـزي حرارتـی عبـارت بـود از50-230 ºC بـا افزایش دماي 3 ºC در دقیقه، درجه حرارت محفظه تزریق
117 ºC در دماي ترانسفرلاین 250 ºC تعیین شـد. سـپس 1 µl از اسانس لعل کوهسـتان بـه دسـتگاه تزریـق شـد و درصد نسبی اجـزاي اصـلی اسـانس بـا اسـتفاده از مـواد استاندارد و مقایسه زمان بازداري شناسایی شد.
میکروارگانیسمهاي مورد مطالعه
از بــین باکتریهــاي گــرم مثبــت subtilis Bacillus
ATCC6051، Bacillus cereus ATCC1247، Listeria
monocytogenes ATCC7644، Staphylococcus
aureus ATCC25923، Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 و Staphylococcus saprophyticus
ATCC13518 و از بین باکتریهـاي گـرم منفـی Shigella
(Clinical isolate) flexeneri، Escherichia coli
ATCC8739، typhimorium Salmonella
ATCC14028،Klebsiella pneumoniae ATCC10031،
aeruginosa ATCC 9027 Pseudomonas، Shigella
dysantri PTCC118، 231 RI vulgaris Proteus،
Vibrio cholera Inaba و aeruginosa Enterobacter
ATCC10006 و قـــارچ (field flavus Aspergillus
isolate) و Aspergillus niger ATCC 16404 و مخمـر
Candida albicans ATCC 10231 انتخاب گردید.
تعیین خاصیت ضد میکروبی اسانس با اسـتفاده از روش
دیسک دیفیوژن
سویههاي باکتریایی روي نوترینت آگـار و سـویههـاي قارچ و مخمر روي سابورودکستروز آگار در دماي 37 ºC
رشد داده شـدند. 2-3 کلنـی از کشـت شـبانه هـر سـویه میکروبـی بـه سـرم فیزیولـوژي اسـتریل افـزوده شـده و
Mahboobi et al.,
فصلنامه تحقیقات گیاهان دارویی و معطر ایران، جلد 24، شماره 1 59
کدورت آنها با 0/5 مک فارلند تنظیم گردید. سوسپانسیون باکتریایی (معادل (1×108 CFU ml-1 آماده بـر روي مـولر هینتـون آگـار و سوسپانسـیون قـارچی (105 CFU ml-1)
روي سابورودکستروز آگار تلقیح گردیده سپس دیسکهاي کاغذي استریل (قطر 6 میلیمتر) حاوي 2 µl اسـانس کـه
در 20 میکرولیتـــر (dimethylsulfoxide) DMSO حـــل
شده است بر روي محیطهاي کشت شـده قـرار داده شـد.
دیسک حاوي DMSO و دیسک آنتـیبیـوتیکی بـهعنـوان
کنتـرل روي کشـت قـرار داده شـد (
(2006 کشتهاي باکتریایی و قارچی بـهترتیـب 24 و 48
ساعت در دماي 37 ºC انکوبه گردیدند. سپس قطـر هالـه عدم رشد (بر اساس میلیمتر) اندازهگیري گردید.
تعیین حداقل غلظت مهار کننده رشد با استفاده از روش
میکروبراث دایلوشن
در ایـن روش سـري دو برابـر رقـت از اسـانس لعـل کوهستان در %10 DMSO بـا غلظـت0/0125-2 µl ml-1
تهیه شد .(NCCLS, 2006) سپس 100 µl از هر رقت بـه هر چاهک از پلیت 96 تایی افـزوده شـد. اسـتاندارد تهیـه شده (معادل بـا 0/5 مـک فارلنـد) در مرحلـه قبـل رقیـق گردید، به نحوي که غلظت سوسپانسیون میکروبـی بـراي باکتریها 105 CFU ml-1 و بـراي قارچهـا 104 CFU ml -1
تنظیم گردید و در مورد باکتریهـا از محـیط مـولر هینتـون براث و در قارچها ومخمرهـا از محـیط RPMI 1640 کـه
pH آن با مورفولین پروپـان سـولفونیلیک اسـید (MOPS) 0/165 مولار به 7/2 رسـیده اسـتفاده گردیـد و 100 µl از سوسپانسیون میکروبی به هر چاهک افزوده شـد و پلیتهـا در دماي 37 بهمدت 24 ساعت براي باکتریهـا و بـهمـدت
48 ساعت براي قارچها انکوبه گردیدند. اولین چاهک کـه در آن هیچ رشدي مشاهده نمـیشـود بـهعنـوان MIC یـا
حداقل غلظت مهارکننده رشد تعیین گردید. سـپس 10 µl
از رقت MIC و چند رقت بالاتر از آن روي محیط کشـت منتقل شده و اولین رقت که در آن رشـدي مشـاهده نشـد بهعنوان MBC یا حداقل غلظت کشنده رشد تعیین گردید.
نتایج
اسانس حاصل از اندام هوایی گیاه لعـل کوهسـتان بـه رنگ زرد و داراي بویی نافذ شبیه به بوي اسانس آویشـن بود. بازده اسانس حاصل از اندام هوایی گیاه %3/4 بدست آمد. نظر بـه اینکـه در مراجـع اجـزاي اسـانس بـهوسـیله
GC/MS شناسایی شده بودند، اجزاي اسانس بهوسیله GC
جداسازي و به روش نرمالیزاسیون درصـد آنهـا مشـخص شد.
