بخشی از مقاله
چکیده
هدف از این مطالعه بررسی تاثیر عصاره های متانولی و آبی آویشن شیرازی برروی کاهش رشد قارچ عامل بیماری کپک آبی سیب در شرایط آزمایشگاه می باشد. براساس نتایج آزمون دیسک کاغذی، عصاره آبی اویشن شیرازی با غلظت های 500 و 300 میکروگرم در میلی لیتر با میزان 2/22 و 76/21 میلی متر بهترین غلظت ها در ممانعت از رشد قارچ بودند، در مورد عصاره الکلی این گیاه غلظت 500 میکرگرم در میلی لیتر بیشترین ممانعت از رشد قارچ ایجاد نمود. نتایج آزمون های بررسی عصاره آبی و الکلی آویشن شیرازی برروی رشد قارچ با استفاده از روش اختلاط با محیط کشت نیز نشان داد که غلظت 2000 پی پی ام به ترتیب با 59/50 و 72/66 درصد ممانعت از قارچ بیمارگر نسبت به شاهد بهترین غلظت مورد استفاده می باشد. با توجه به نتایج این تحقیق مشخص شد که عصاره الکلی و آبی آویشن اسطوخودوس در شرایط آزمایشگاه قادر به اثر مستقیم قارچ کشی علیه بیماری کپک آبی سیب می باشد. کلمات کلیدی: آویشن شیرازی، عصاره، کپک آبی
مقدمه
سیب یکی از مهمترین محصولات باغی در ایران و همچنین در جهان محسوب میشود. نظر به تولید زیاد این محصول در یک فصل به خصوص از سال، نیاز این محصول به انبارداری امری اجتناب ناپذیر است. از طرف دیگر به علت کمبود انبارهای مجهز به تکنولوژی مناسب، این محصول همواره در معرض خسارات زیادی از جمله بیماریی¬های قارچی است - Janisiewicz & Korestent, . - 2002 کپک آبی سیب یکی از مهمترین ببیماری هایی است که همواره به سیب در داخل انبار خسارت وارد میکند - Gholamnejad . - et al., 2009 استفاده از قارچکش های شیمیایی یکی از سریعترین راههای مبارزه با بیماریهای گیاهی است، اما آسیب به محیط-زیست و سلامت انسان از یک طرف و مقامت عوامل بیماریزا به ترکیبات شیمیایی از طرف دیگر، محققان را بر آن داشت که به دنبال روش های جایگزین جهت جلوگیری از آثار مخرب این ترکیبات باشند . - Gholamnezhad et al., 2018 - عصارههای گیاهی ترکیباتی با منشأ طبیعی هستند که آثار مخربی بر سلامت انسان ندارند، سریع تجزیه می¬شوند و تا حالا گزارشی مبنی بر مقاومت بیمارگرها نسبت به اسانس¬ها و عصاره¬های گیاهی گزارش نشده است .عصاره های گیاهی علاوه بر اینکه خاصیت ضدمیکروبی دارند قادرند بعضی از مکانیسم¬های دفاعی گیاه را در برابر عوامل میکروبی از جمله قارچی فعال¬ کنند . - Gholamnezhad et al., 2016a - آویشن شیرازی گیاهی است بوتهای از خانواده نعنائیان. دارای ساقههای منشعب و شاخههای متعدد نازک و برگهای کوچک تقریباً دایرهای شکل است. عصاره حاصل از آویشن شیرازی درصد بالایی از ترکیبات ضدمیکروبی و ضدقارچی را دارد. دراسانس این گیاه ترکیبات فنلی ضدمیکروبی شامل تیمول و کارواکرول می باشد نظر به اینکه بیماری کپک آبی سیب یکی از مهمترین بیماری های پس از برداشت سیب می¬باشد، و از طرفی تیمار سیب¬ها در انبار با سموم قارچکش باعث تهدید سلامت انسان و محیط زیست می شود، در این مطالعه تأثیر عصاره آویشن شیرازی در آزمایشگاه بر روی میزان کاهش رشد قارچ بررسی کردیم.
مواد و روشها
رقم سیبی که در این تحقیق مورد استفاده قرار گرفتند شامل رقم زرد - Golden delicious - بود. این رقم از باغ های سیب شهرستان سمیرم استان اصفهان که به صورت ارگانیک و بدون مصرف آفتکش شیمیایی بودند تهیه شد.
تهیه زادمایه برای تهیه زادمایه بیمارگر از کشت خالص جدایه بیماری زای قارچ P1 P. expansum روی محیط کشت PDA استفاده شد . این جدایههای از آزمایشگاه گروه گیاهپزشکی پرردیس ابوریحان دانشگاه تهران دریافت شدند . - Gholamnezhad et al., 2016b -
عصاره گیاهی
در این تحقیق، از عصاره گیاه آویشن شیرازی - قسمتهای هوایی - استفاده شد. این گیاه ابتدا شستشوی سطحی شده و سپس به وسیله هیپوکلریت % 2 به مدت 5 دقیقه ضدعفونی و سپس با آب مقطر استریل سه مرتبه شسته شدند . - Alam et al., 2014 - نمونههای گیاهی در شرایط آزمایشگاه و دور از تابش مستقیم نور آفتاب خشک شدند. سپس اندامهای هوایی به وسیله خردکن پودر شده و از الک یک مش عبور داده شدند . - Abdul Aziz, 2010 - تهیه عصارههای گیاهی به دو روش استفاده از متانول و آب انجام شد. در روش استفاده از متانول، پنج گرم از ماده خشک گیاهی در 100ml متانول خالص - شرکت - Merk خیسانده شد و بعد از 24 ساعت ماده گیاهی همراه متانول در یک هاون چینی ساییده شد. در مرحله آخر به کمک دکانتور بخش های مختلف عصاره از هم دیگر جدا شده و بخش متانولی جهت تبخیر متانول و استحصال عصاره در زیر هود قرار داده شد . - Bahraminejad et al., 2008 - در روش دوم بعد از ضدعفونی سطحی نمونه های گیاهی پنج گرم از ماده خشک گیاهی در 100 میلیلیتر آب مقطر استریل خیسانده شد و پس از 24 ساعت از پارچه ململ عبور داده شد و سانتریفوژ شد. در این مرحله به منظور استریل کردن عصاره آبی از صافی میکروبیولوژیک دو میکرونی استفاده شد . - Azimim et al., 2006 -
تأثیر عصاره های گیاهی بر رشد قارچ بیمارگر با استفاده از روش دیسک کاغذی
مقدار 0، 150، 300 و 500 میلیگرم از هر عصاره در یکمیلیلیتر از حلال مناسب حل شد و مورد استفاده قرار گرفت - Meliss . - et al., 2005 در مورد عصاره آبی از آب مقطر و در مورد عصارههای متانولی از متانول %45 به عنوان حلال استفاده شد. سپس 50 میکرولیتر از هر نمونه - طی پنج مرحله، هربار 10 میکرولیتر - با استفاده از سمپلر روی دیسکهای کاغذ صافی به قطر شش میلیلیتر بارگذاری شده و برای تبخیر حلال در فضای آزمایشگاه قرار داده شد. برای بررسی اثر آنتیمیکروبیال عصارههای گیاهی از حاشیه کلنی هفت روزه قارچ بیمارگر - ایزوله - P1 روی محیط PDA، قرصهایی به قطر 6mm توسط چوب پنبه سوراخکن تهیه و در وسط پتری حاوی محیط PDA قرار داده شد. در دمای 25 درجه سانتیگراد در انکوباتور، قطر کلنی قارچ بیمارگر بعد از 24 ساعت به حدود 1/5 cm رسید. پس از این مرحله دیسکهای حاوی عصارهها در فاصله 2cm حاشیه روییده قارچ قرار داده شد، سپس در فواصل زمانی مختلف، شعاع هاله بازدارندگی از روبرو پتری یادداشت برداری شد و میانگین آن در محاسبات لحاظ شد. در این آزمایش، از حلال مورد نظر به عنوان شاهد منفی استفاده شد. آزمایش در چهار تکرار انجام شد. به منظور بررسی اثر قارچکشی و یا قارچ ایستایی عصارههای موثر گیاهی قطعه کوچکی از میسلیوم قارچ برداشته و روی محیط PDA واکشت شد تا رشد یا عدم رشد قارچ روی محیط کشت جدید بررسی شود .
-7-3 تأثیر عصارههای گیاهی بر رشد قارچ بیمارگر با استفاده از روش اختلاط با محیط کشت
در هر ظرف پتری که حاوی 20ml محیطکشت PDA بود، عصارههای گیاهی - بند - 4-3 در غلظتهای 0، 500، 1000، 1500 و 2000 پی¬پی¬ام به همراه 0/005 درصد تویین 80 به محیط کشت اضافه شد. پلاکی از حاشیهکشت هفت روزه قارچ بیمارگر در مرکز ظروف پتری قرار داده شد و تا روز پنجم قطر میسلیومی آن اندازهگیری شد. تمامی مراحل در شرایط استریل و در سه تکرارصورت گرفت و همه آزمایشات دو بار انجام شد . - Gholamnejad et al., 2009 - درصد بازدارندگی رشد میسلیومی هر تیمار از فرمول زیر - 1 - محاسبه شد:
فرمول - 1 - - A−B - = درصد بازدارندگی رشد قارچ
:A قطر کلنی در شاهد :B قطر کلنی در تیمار
.نتایج
تأثیر عصاره گیاه آویشن بر رشد قارچ بیمارگر با استفاده از روش دیسک کاغذی بر اساس داده های حاصل از تجزیه واریانس، به احتمال 99 درصد بین غلظتهای مختلف عصاره آویشن در هر دو روش استفاده از عصارههای آبی و متانولی بر کاهش میزان رشد هاله قارچ، به روش آزمون دیسک اختلاف معنیدار وجود دارد. در این آزمون، عصاره آبی آویشنشیرازی با غلظت 500 و 300 میکروگرم در میلیلیتر و 22/21 و 21/76 میلیمتر قطر ممانعت از قارچ بیمارگر، بهترین غلظتها بودند. کمترین ممانعت کنندگی مربوط به شاهد بود که میزان آن به ترتیب 1/56 میلی متر قطر ممانعت
