بخشی از مقاله
چکیده:
به منظور پیشنهاد ریزنمونه مناسب و غلظت معینی از تنظیمکنندههای رشد جهت تولید کالوس، تأثیر اکسینهای ایندول بوتریک اسید - IBA - ، نفالین استیک اسید - NAA - و 2و 4 دیکلروفنوکسی استیک اسید - 2, 4- D - بر میزان تولید و رشد کالوس سرخدار در شرایط درون شیشهای مورد بررسی قرار گرفت. در این تحقیق از قسمتهای مختلف درخت نظیر برگ، ساقههای جوان و جوانه-های رویشی ریز نمونههایی به طول 1/5 سانتیمتر تهیه شد. ریزنمونهها پس از سترونسازی در محیط کشت موراشیگ و اسکوگ - MS - کشت شدند. جهت القاء کالوس از هورمونهای IBA، NAA و 2,4- D در چهار سطوح 0، 0/3، 3 و 6 میلیگرم در لیتر استفاده شد. نتایج تحقیق نشان داد که بهترین روش برای سترونسازی ریزنمونهها استفاده از اتانول 70 درصد 1 - دقیقه - و کلرید جیوه 0/2 درصد و کلرور کلسیم 0/2 درصد 1 - دقیقه - میباشد. بیشترین وزن تر و خشک کالوس به ریزنمونههای ساقه و جوانه تعلق داشت که به ترتیب تحت تیمار هورمونهای 2, 4- D و NAA با غلظت 3 میلیگرم در لیتر بودند. بیشتر ریزنمونههای جوانه در غلظت 0/3 میلیگرم در لیتر NAA وضعیت طبیعی خود را حفظ کرده ولی عمده جوانهها در غلظت 6 میلیگرم در لیتر IBA و 2, 4- D به کالوس تبدیل شدند. درصورتیکه هدف، تولید کالوس از ریزنمونههای ساقه و برگ سرخدار باشد، 2, 4- D با غلظت 3 میلیگرم در لیتر، و برای تولید کالوس از جوانه انتهایی غلظت 3 میلیگرم در لیتر NAA و جهت تولید گیاهچه از جوانههای سرخدار، غلظت 0/3 میلیگرم NAA به عنوان پروتکلهایی مناسب، پیشنهاد میگردند.
کلمات کلیدی: سرخدار- کالوس- تنظیمکنندههای رشد- کشت درون شیشهای.
مقدمه
استفاده از کشت سلول و بافت از اندامهای مختلف سرخدار در شرایط آزمایشگاهی یکی از روشهای جایگزین، برای تولید این ماده دارویی میباشد. اولین گزارش درباره تولید کالوس از گامتوفیت سرخدار توسط روهر در سال 1973 منتشر شد . - 22 - گیبسون و همکاران - 1993 - در بررسی میزان رشد کالوس روی Taxus brevifolia Nutt.، با استفاده از ریزنمونههای پوست، ساقه و برگ در محیط کشتهای محتلف نظیر B5، MS، White و DKW به همراه غلظتهای مختلفی از تنظیم کنندههای رشد نظیر NAA، BA، 2, 4- D و Picloram به این نتیجه رسیدند که ریزنمونهها بعد از 2 هفته شروع به تولید کالوس کرده و محیط کشتهای WPM با 2 میلیگرم در لیتر 2, 4- D و B5 با 1 تا 2 میلیگرم در لیتر 2, 4- D دارای نتایج بهتری بودند . - 10 - اسجزانا و همکاران - 2002 - با بررسی تأثیر محل اخذ ریزنمونه و تنظیم کنندههای رشد روی میزان رشد کالوس Taxus baccata L. در شرایط درون شیشهای با استفاده از ریزنمونههای جنینهای جنسی و سرشاخههای جوان در غلظتهای مختلفی از تنظیمکنندههای رشد در محیط کشت MS نشان دادند که بهترین کالوس از جنینهای جنسی، در محیط کشت MS به همراه 3 میلیگرم در لیتر 2, 4- D،0/5 میلیگرم در لیترKin و 2 درصد ساکارز حاصل شد که دارای رنگ زرد تیره بودند همچنین ریزنمونههای تهیه شده از سرشاخههای نازک، در محیط کشت مذکور به همراه 3 میلیگرم در لیتر NAA، 0/5 میلیگرم در لیترKin و 2/5 درصد ساکارز واجد کالوسی به رنگ زرد کمرنگ تا سفید شدند . - 21 - عباسیان و همکاران - 2010 - جهت تولید گیاهچههای سرخدار با استفاده از جوانه انتهایی، در محیط کشتهای MS، B5 و WPM و غلظتهای مختلفی از BAP، Zeatin، Kin، IBA و NAA به این نتیجه رسیدند که محیط کشت MS به همراه 2 میلیگرم در لیتر BAP بیشترین تولید جوانهها و رشد آنها را به همراه داشته است و اضافه کردن 0/3 میلیگرم در لیتر NAA به محیط کشت مذکور باعث افزایش کالوس شد . - 1 - غفوری و همکاران - 2012 - برای سترونسازی ریزنمونههای ساقه و برگ T. baccata از هیپوکلریت سدیم 3 درصد به مدت 15 دقیقه و اتانول 70 درصد به مدت 1 دقیقه و برای کاهش قهوهای شدن آنها از گلوتامین در غلظتهای مختلف استفاده نمودند. در این بررسی غلظت 0/1 میلیمول گلوتامین ضمن کاهش پدیده قهوهای شدن باعث افزایش تولید کالوس گردید . - 9 - کریمیان و همکاران - 2014 - با بررسی تأثیر غلظتهای مختلف 0/ 5 - 2, 4- D، 1 و 1/5 میلیگرم در لیتر - و 0/1 - Kin، 0/5 و 1 میلیگرم در لیتر - بر کالوسزایی ریزنمونههای ساقه T. brevifolia در محیط کشت MS، بهترین میزان تولید کالوس را غلظت 1/5 میلیگرم در لیتر 2, 4- D و 0/1 میلیگرم در لیتر Kin معرفی کردند . - 15 - هدف از تحقیق حاضر تعیین ریزنمونه مناسب و غلظت معینی از تنظیم کنندههای رشد جهت تولید کالوس در کشت بافت گیاهی میباشد.
مواد و روشها
در تحقیق حاضر ریزنمونههای مورد نیاز از تودههای طبیعی سرخدار در منطقه افراتخته تهیه شد. رویشگاه سرخدار افراتخته به وسعت 352 هکتار در 30 کیلومتری جنوب شرقی شهرستان علیآباد کتول استان گلستان در مجاورت روستای ییلاقی افراتخته قرار دارد.
روش تهیه و سترونسازی ریزنمونهها
در این تحقیق از قسمتهای مختلف درخت نظیر برگ، ساقههای جوان سبز رنگ - یک تا دوساله - و نیز جوانههای رویشی ریز نمونههایی به طول 1/5 سانتیمتر تهیه شد. جهت سترونسازی 12 تیمار سترونسازی در نظر گرفته شد.
تجزیه و تحلیل آماری
این تحقیق به صورت آزمایش فاکتوریل سه عامله در قالب طرح پایه کاملاً تصادفی انجام شد. جهت بررسی وجود اختلاف بین میانگینها از آزمون تجزیه واریانس دو طرفه و برای مقایسه میانگینها از آزمون دانکن استفاده شد.
نتایج و بحث مقایسه میانگین درصد قهوهای شدن ریزنمونهها و وزن تر و خشک کالوس در ریزنمونههای سرخدار
نتایج تجزیه واریانس نشان میدهد که اختلاف معنیداری بین اثر متقابل نوع ریزنمونه، نوع هورمون و غلظتهای مختلف هورمون در تمامی مشخصههای مورد بررسی وجود دارد.
Explant - ریز نمونه - B= Hormone , - هورمون - C= Concentration , - غلظت - وجود حداقل یک حرف مشترک بین میانگینها نشاندهنده عدم اختلاف معنیدار میباشد.
ریزنمونههای جوانه در غلظت 6 میلیگرم در لیتر NAA بیشترین درصد قهوهای شدن را به خود اختصاص دادند - جدول . - 1 ضمناینکه میزان قهوهای شدن در ریز نمونههای برگ و جوانه با افزایش غلظت هورمون NAA افزایش مییابد. از آنجائیکه افزایش غلظت NAA باعث کاهش فتوسنتز برگها میشود - 5 - بنابراین افزایش غلظت هورمون مذکور با کاهش فعالیت فتوسنتزی برگ باعث قهوهای شدن آنها شده است. از آنجائیکه کلیه ریزنمونهها در فصل بهار جمعآوری شدند و جوانهها در فصل رویش فاقد فلس-های محافظ میباشند آسیب بیشتری دیدهاند. به طور کلی ریزنمونههای برگ از نظر پدیده قهوهای شدن نسبت به سایر ریزنمونهها از وضعیت بهتری برخوردار بودهاند بطوریکه در غلظتهای مختلف IBA و 2, 4- D هیچگونه آثار قهوهای شدن مشاهده نشد.
مقایسه میانگین وزن تر و خشک کالوس توسط آزمون دانکن در ریزنمونههای سرخدار
بیشترین وزن تر و خشک کالوس تولید شده در ریزنمونههای ساقه، برگ و جوانه سرخدار متعلق به تیمار هورمونهای 2, 4- D و NAA با غلظت 3 میلیگرم در لیتر بودند و در ریزنمونههای ساقه بیشترین وزن تر و خشک به تیمار 3 میلیگرم در لیتر 2, 4- D تعلق دارد.
از آنجائیکه وجود هورمونهای تحریک کننده رشد برای تولید کالوس و یا اندام در ریزنمونههای مورد بررسی ضروری میباشد 7 - و - 3 بنابراین عدم واکنش ریزنمونهها در شاهد - غلظت صفر - امری طبیعی است. نتیجه این تحقیق با نتایج تحقیق غفوری و همکاران - 2012 - مبنی بر تولید بیشتر کالوس توسط ریزنمونههای ساقه نسبت به ریزنمونههای برگ و نیز تأثیر بیشتر 2, 4- D در تولید کالوس نسبت به سایر اکسینها - 9 - و نیز نتایج کریمیان و همکاران - 2014 - مبنی بر تأثیر بیشتر 2, 4- D در کالوسزایی ریزنمونههای ساقه T. brevifolia نسبت به Kin همسو است . - 16 - قابل ذکر است که در بررسی اسجزانا و همکاران - 2002 - بیشترین کالوس در غلظت 3 میلیگرم در لیتر NAA به همراه 0/5 میلیگرم در لیتر Kin تولید شده است . - 22 -
کالوسهای تولید شده در تیمارهای مربوط به IBA سبز کمرنگ، در NAA سبز تیره و در 2, 4- D دارای دو بخش جداگانه به رنگهای سبز پستهای و زرد میباشد که از نشانههای تمایز کالوس تولید شده میباشد. مهدینژاد و همکاران - 2015 - بیشترین مقدار کالوس را از ریزنمونههای برگ سرخدار در محیط کشت MS به همراه 0/25 میلیگرم درلیتر Kin و 2 میلیگرم در لیتر NAA بدست آورند که کالوسهای حاصل دارای رنگ قهوهای تیره بودند . - 19 -
میزان رویش طبیعی ریزنمونههای جوانه در غلظتهای مختلف هورمونی
مقایسه میانگین درصد ریزنمونههای جوانه سرخدار، که تحت تأثیر هورمونهای IBA، NAA و 2, 4- D در غلظتهای مختلف قرار گرفتند و شکل طبیعی خود را حفظ کردند توسط آزمون تجزیه واریانس نشان میدهد که اختلاف آماری معنیداری F=226/609 - و - Sig= 0/000 بین تیمارها وجود دارد - جدول . - 2
