بخشی از مقاله
بررسی چند شکلی ژن میوستاتین (MSTN) در اسب های ترکمن ایران
چکیده
روش های نوین مولکولی بر تجزیه و تحلیل ژنوم متمرکز است، تا اطلاعات جدیدی را برای ارزیابی صفات مهم اقتصادی در حیوانات مزرعه ای فراهم آورد. یکی از صفات مهم و اقتصادی در اسبها، سرعت دویدن آنهاست. یکی از ژن های تاثیر گذار بر روی صفت دویدن اسبها، ژن میوستاتین است. این ژن برای اولین بار در اسب تاروبرد و بر روی کروموزوم 18 شناسایی شد. ژن میوستاتین تنظیم کننده رشد ماهیچه اسکلتی در طیفی از گونه های پستانداران مانند اسب می باشد. این ژن تنظیم کننده هم تعداد و هم رشد فیبرهای عضله می باشد. ژن میوستاتین در حیوانات اهلی به منظور پیش بینی عملکرد، شایستگی و موفقیت در رقابت از نظر تجاری مهم باشد. جهش در ژن میوستاتین باعث افزایش توده عضلانی و همچنین باعث کمک در عملکرد بهتر سرعت در اسبها و سگهای مسابقه ای با ژنوتیپ هتروزیگوت می شود. در این تحقیق پس از تهیه نمونه خون از 103 رأس اسب ترکمن، استخراج DNA با استفاده از کیت تجاری انجام شد. پس از استخراج DNA قطعه 600 جفت بازی در ناحیه پروموتور ژن میوستاتین با روش PCR تکثیر شد. شناسایی ژنوتیپ ها به روش تعیین اندازه قطعات محصول PCR بر روی ژل آگارز 2 در صد انجام گرفت. با توجه به عدم مشاهده چند شکلی و مونوفورف بودن حیوانات بلحاظ این جایگاه، و در نهایت هرچند نتیجه تحقیق حاضر در 103 رأس اسب انجام گردید ولی احتمالا در تمامی اسب های این نژاد چند شکلی وجود ندارد و برای انتخاب حیوانات برتر لازم است سایر جایگاه های ژنی مرتبط با سرعت مورد مطالعه قرار گیرند.
واژگان کلیدی: اسب ترکمن، ژن میوستاتین، چند شکلی
مقدمه
از حدود 5555 تا 6555 سال پیش، انسان برای تامین نیاز خود، آمیزش اسب ها را بر اساس اهداف خود انجام داده است. این امر که به انتخاب مصنوعی معروف است سبب تغییر ژنتیکی در جوامع اسب ها و در نتیجه، تولید حیواناتی با توانایی های مورد انتظار بوده است (مریدی و همکاران، .(1391 امروزه نژادهای مختلفی از اسب در جهان وجود دارد که از نظر نوع فعالیت، تیپ، رنگ، وزن، شکل و غیره با یکدیگر تفاوتهای زیادی دارند (گلشن و رجبی، .(1384 نژادهای بومی در هر کشور به عنوان سرمایه ملی تلقی گشته و حفظ و تکثیر آنها از ارزش و اهمیت زیادی برخوردار است. سرزمین پهناور ایران به علت شرایط خاص جغرافیایی دارای اقلیم های متنوعی است، در چنین شرایطی انتخاب های طبیعی و مصنوعی موجب شده است که نژادهای حیوانات اهلی با استعدادهای متنوع در این کشور بوجود آید (بهروزی نیا و همکاران، .(1390 ایران دارای حدود 155 هزار رأس اسب می باشد. جمعیت های تشکیل دهنده اسب های بومی ایران شامل اسبهای عرب، ترکمن، کرد، و اسبچه خزر می باشد (مریدی و همکاران، .(1391 یکی از با ارزش ترین نژادهای اسب ایران، اسب ترکمن است. این اسب در منطقه شمال شرقی ایران در استانهای گلستان و خراسان شمالی توسط اقوام ترکمن پرورش می یابد. اندام متناسب، بدن کشیده و با ظرافت، اندام حرکتی مستحکم و در عین حال ظریف، نیم رخ صاف یا برجسته، بخلوق کوتاه، سینه باریک و پشت و کمر کوتاه و مستقیم، گردن طویل و به لحاظ وزنی میان وزن بودن از خصوصیات این نژاد است. اسب ترکمن دارای تیره های یموت،گوگلان و آخال تکه می باشد، که هر یک از این تیره ها نسبت به سایرین تفاوت های جزیی را از خود نشان می دهند ولی اکثرا از نظر کار آیی یکسان هستند (خلیلی، .(1387 روش های نوین مولکولی بر تجزیه و تحلیل ژنوم متمرکز است، تا عرضه و اطلاعات جدیدی را برای ارزیابی صفات مهم اقتصادی در حیوانات مزرعه ای فراهم آورد ( .( Madeja et al, 2004 یکی از صفات اقتصادی و مهم مورد اندازه گیری در اسبها سرعت دویدن آنهاست (خلیلی، .(1387 یکی از ژن های تاثیر گذار بر روی صفت دویدن اسبها، ژن میوستاتین است. این ژن برای اولین بار در اسب تاروبرد و بر روی کروموزوم 18 شناسایی شد .(Hill et al, 2010) ژن میوستاتین از 3 اگزون و 2 اینترون ساخته شده است ( .( Dall’Olio et al, 2010 شواهد علمی اخیر اظهار دارند که ژن میوستاتین تنظیم کننده رشد ماهیچه اسکلتی در طیفی از گونه های پستانداران مانند اسب می باشد .(McPherron, and Lee, 1997) این ژن تنظیم کننده هم تعداد و هم رشد فیبرهای عضله می باشد .(HILL et al , 2011) براساس تحقیقات انجام شده آنالیز جایگاه ژن میوستاتین می تواند به شدت برای پیش گویی عملکرد حیوانات و تاثیر اصلاح نژاد بسیار سودمند باشد .(Hill et al, 2010) پژوهش در مکانیسم عمل میوستاتین نشان داده که میوستاتین به شدت شکل اندام استقامتی، بویژه در فرم غیر فعال آن تحت تأثیر قرار می دهد ( .(Tozaki et al, 2011 مطالعات دانشمندان نشان داده اسبهایی که فاقد آلل های وحشی ژن میوستاتین می باشند عضلات بزرگ و قابل توجهی دارند ( Cash .( et. al, 2009 جهش در ژن میوستاتین گونه های مختلف پستانداران با افزایش ماهیچه ها در ارتباط است که این موضوع می تواند قدرت عملکردی را افزایش دهد .( Deveaux et. al, 2001) جهش های طبیعی ژن میوستاتین اسب در اگزون، اینترون و نواحی تنظیمی شناسایی شده است .(Hill et al, 2010) بنابراین ژن میوستاتین در حیوانات اهلی به منظور پیش بینی عملکرد، شایستگی و موفقیت در رقابت می تواند از نظر تجاری مهم باشد، بدلیل اینکه ژن میوستاتین به افزایش فیبرهای عضلانی در طیف وسیعی از گونه های پستانداران کمک می کند. کاهش یا جهش میوستاتین در اطراف توالی کد کننده ژن میوستاتین باعث افزایش توده عضلانی در اسکلت، بویژه در شانه ها و ران ها می شود(.( Pherron, and Lee, 1997 و از این طریق باعث کمک در عملکرد بهتر سرعت در سگهای مسابقه ای با ژنوتیپ هتروزیگوت می شود(.( Mosher et. al, 2007 در پژوهشی در اسبهای تاروبرد ژن میوستاتین در 3 گروه مخصوص سازمان دهی شد .(C:C ,C: T ,T:T) نتیجه گرفته شد که اسبهای دارای ژنوتیپ (T:T) در مسا فت های متوسط به بالا، اسب های دارای ژنوتیپ (C:T) در مسافت های متوسط و اسب های دارای ژنوتیپ (C:C) در مسا فت های کوتاه موفق تر هستند.(Hill et al, 2010)
با توجه به اهمیت و تاثیر ژن میوستاتین بر سرعت اسب و اهمیت استفاده اسب ترکمن در مسابقات اسبدوانی و عدم بررسی ژن مذکور در اسب های بومی ایران به ویژه اسب ترکمن، تحقیق حاضر با هدف بررسی وجود چند شکلی ژن میوستاتین در اسب ترکمن صورت گرفته است.
مواد و روش ها
خونگیری
دراین آزمایش، از153رأس اسب ترکمن موجود در استانهای گلستان و خراسان شمالی که ریجستر شده فدراسیون سوارکاری می باشند، به صورت تصادفی خونگیری به عمل آمد. خونگیری پس از مقید کردن اسب با روش های رایج از سمت چپ و با استفاده از ونوجکت ها ی وکیوم دار حاوی EDTA به میزان 5 سی سی از رگ گردن انجام شد. نمونه های جمع آوری شده درمخزن حاوی یخ نگهداری و به آزمایشگاه ژنتیک دانشکده علوم دامی، دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان منتقل شدند.
استخراج DNA و تعیین ژنوتیپ
به منظور افزایش دقت کار و کیفیت مطلوب نمونه های DNA، استخراج DNA با استفاده از کیت DIATOM DNA Prep155 انجام شده وجهت ارزیابی کمیت وکیفیت DNA بدست آمده از ژل آگارز 5/8 درصد استفاده گردید. DNA های ژنومی استخراج شده با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی (جدول-( 1 مورد استفاده قرار گرفت. واکنش زنجیره ای پلی مراز برای ناحیه پروموتور ژن میوستاتین در حجم 20 میکرولیتر انجام گرفت، به طوری که برای هر واکنش، 9 میکرولیتر master mix، 2 میکرولیتر DNA با غلظت 10-80 نانو گرم در میکرولیتر، 2/5 میکرو لیتر مخلوط آغازگرهای رفت و برگشت با غلظت 10پیکومول بر میکرو لیتر و 6 میکرولیتر آب فاقد یون باهم مخلوط شدند. سپس میکروتیوپ های حاوی نمونه به مدت چند ثانیه با دور10000rpm سانتریفیوژ شدند. بعد از اتمام سانتریفیوژ، یک قطره روغن معدنی به هر نمونه اضافه شد تا از تبخیر محتویات میکروتیوپ جلوگیری شود. پروفیل حرارتی واکنش زنجیره ای پلیمراز شامل یک مرحله ابتدایی واسرشته سازی در دمای95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه و 35 چرخه اصلی واکنش ( واسرشته سازی در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 35 ثانیه، اتصال آغازگر به رشته الگو در دمای 58 درجه سانتیگراد به مدت 35 ثانیه و بسط آنزیمی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 65 ثانیه) و مرحله بسط آنزیمی نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 9 دقیقه اجرا شد.
(Hill et al, 2010) و .(Dall’Olio et al, 2014) پس از تکثیر، جهت اطمینان از تکثیر ژن مورد نظر، 4 میکرولیتر محصول PCR به همراه 2 میکرولیتر Loading buffer پس از مخلوط شدن، در چاهک مربوطه ژل آگارز %2 ریخته شد و برای رؤیت باند و عکس برداری از دستگاه ژل داک استفاده شد. تعیین ژنوتیپ بر اساس تعیین اندازه محصول PCR انجام شد. اسبهای دارای باند در ناحیه 655 جفت بازی دارای ژنونوتیپ (TT)، اسبهای دارای باند در ناحیه 827 جفت بازی دارای ژنونوتیپ (CC) و اسبهای دارای باند در هردو ناحیه 655 و 827 جفت بازی دارای ژنونوتیپ (TC) خواهند بود (Hill et al, 2010) .(Dall’Olio et al, 2014)
نتایج
نتیجه الکتروفورز محصولات استخراج DNA با ژل آگارز وجود باند با کیفیت مطلوب را نشان داد که مشخص نمود که عمل استخراج DNA به خوبی انجام شده است (شکل .(1 مشاهده باند در موقعیت 655 جفت بازی نشان دهنده تکثیر مناسب قطعه انتخاب شده در دمای مذکور و صحت انجام PCR بود. اگر چه سه نوع ژنوتیپ TT،TC وCC قابل انتظار بودند، اما در این تحقیق همه افراد دارای ژنوتیپ TT بودند و هیچ جهشی در این ژن مورد شناسایی قرار نگرفت (شکل .(2 به عبارت دیگر در این تحقیق تنها آلل T با فراوانی 1 مشاهده گردید.
