بخشی از مقاله
خلاصه :
تولیدمثل فعایت پایه اي ارگانیسم براي ادامه حیات یک گونه از یک نسل به نسل دیگر است.مطالعه سیستم تولید مثلی وشناخت بیولوژي پایه اي براي رسیدن به این جنبه ازحیات مهم است. بلاستوسیت تولید شده پس از هچ شدن ازلایه زونا باید به دیواره رحم چسبیده و ارتباط خونی خود را با مادر اغاز کند. فرایند لانه گزینی ملزم یک برهمکنش دوجانبه بین بلاستوسسیت و اندومتریوم است که شامل جنین با برنامه هاي مولکولی رشد سلولها و تمایزشان وتمایز موقتی سلولهاي اندومتریوم براي بدست اوردن قابلیت جذب است . لانه گزینی بوسیله یکسري از واسطه هاي اندوکرینی، پاراکرینی و اتوکرینی کنترل می شود. درك بهتر مکانیسم لانه گزینی واهمیت فاکتورهاي موثر در این فرایند مهم است.لذا دراین تحقیق تاثیر هورمون پروژسترون بر بیان ژن فاکتور هايIGFIو IGFII در سلولهاي اندومتریوم گوسفند مورد بررسی قرار گرفت.
مواد وروش کار:
پس از کشت سلول اندومتر رحم گوسفند و اضافه کردن هورمون پروژسترون به محیط کشت این سلولها mRNA از این سلولها را استخراج کرده ،وسپس با استفاده از روش RT-PCR بیان ژن IGFIIوIGFI مورد مطالعه قرار گرفت و محصولات PCR بروي ژل آگارز % 1.5 ران شدند..بیان ژنIGFII و IGFIدرگروه کنترل وگروه چالش مقایسه گردید.
نتایج :
تفاوت معنی داري در بیان ژن هاي IGFIIوIGFI دربین گروه کنترل و تیمارهاي پروژسترون مشاهده نشد. این نتایج عنوان میدارد که پروژسترون در بیان ژنIGFII وIGFI تاثیري ندارد. انجام بررسی ها ي دقیقتر مانند-RealTime PCRبه منظور بررسی تفاوت هاي کمی موجود در بیان این ژنها در بین تیمارهاي مختلف توصیه می گردد.
مقدمه
اندومتریوم یک اندام مهم در سیستم تولید مثل پستانداران است. جنین پس از طی چندین روز که در اویداکت رشد می کند به لایه اپی تلیال اندومتریوم می چسبد و فرایند لانه گزینی آغاز می گردد - . - 1 و تا زمان زایمان اندومتریوم مواد مغذي را براي جنین فراهم می کند. یکسري فاکتورهاي اندوکرینی و پاراکرینی وجود دارند که براي زنده مانی جنین ضروري می باشند - . - 2 فرایند چسبیدن جنین به اندومتریوم و جایگزینی آن در سلولهاي اندومتریوم تحت ناثیر یکسري تغییرات سلولی و مولکولی در اندومتریوم که کنترل این مکانیسم ها ناشناخته است - . - 3 بعلاوه عملکرد سلول در سطح مولکلولی توسط مطالعات کمی آنالیز بیان mRNA در طی کشت و پس از تحریک با هورمون بروي هم سلول هاي اویداکت و اندومتریوم انجام شده است و نتایج این مطالعات نشان دهنده حضور و تنظیم فیزیولوژیکی رسپتورهاي استروئیدي در این اندام ها است - . - 4 در این مطالعه ما بیان ژنهاي IGF-I و IGF-II را پس از تحریک هورمونی بوسیله تکنیک RT-PCR بررسی کردیم.
مواد و روشها
بافت:
در کشتار گاه نزدیک به محل انجام آزمایش اندام تناسلی گوسفند ماده تهیه شد. لوله هاي رحمی از دیگر قسمت هاي اندام تناسلی جدا شدند. بافت هاي اظافی، رگ هاي خونی و چربی هاي متصل به رحمی جدا شدند. لول هاي رحمی را پس از جدا سازي بافت هاي اظافی با بافر فسفات حاوي 100 واحد بین المللی از هر کدام از آنتی بیوتیک هاي استرپتومایسین و جنتامایسین شستشو داده. سپس در شرایط دمایی 4 درجه سانتی گراد به آزمایشگاه انتقال داده.
جدا سازي سلول هاي اندومتریوم، کشت و تیمار کردن با هورمون
پس از انتقال به آزمایشگاه لوله هاي رحمی با الکل 70 درصد شستشو و سپس در داخل بافر فسفات قرار داده شدند. سلول هاي اپی تلیال اندومتریوم بوسیله ترکیبی از روشهاي مکانیکی و آنزیمی که از آنزیم هاي تریپسین و کلاژناز استفاده گردید جدا شدند. سلولها در محیط مغذي M199 که با 10 درصد سرم جنینی گوساله و هورمون پروژسترون همراه بود کشت داده شدند - شکل . - 1 غلظت هورمون هاي مورد استفاده در این تحقیق هر کدام 10 نانو گرم درهر میلی لیتر محیط کشت بود.
استخراج RNA و انجام RT-PCR
کل RNA سلولی از سلولها در مرحله قبل از کشت و 24 ساعت پس از کشت و تحریک هورمونی بوسیله کیت استخراج RNA شرکت کیاژن - - Qiagen با توجه به دستورالعمل کارخانه اسخراج شد. براي بررسی کمیت RNA استخراج شده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 260 نانو متر استفاده شد و سپس در دماي -70 سانتی گراد نگهداري شدند. براي سنتز cDNA یک میکروگرم از هر نمونه RNA در حجم کلی 20 میکروگرم ،, 1ʽ oligo dT - fermentas - , 1ʽ dNTP - Qiagen - , 4ʽ of 5X buffer، ʽl 0.5 inhibitor, 1ʽ RT Rnas ، براي سنتز رشته دوم cDNA استفاده شد. ما از تکنیک با استفاده پرایمرهاي تخصصی براي ژنهاي IGF-I و IGF-II استفاده کردیم. همه قطعات تکثیر شده در ژل آگارز 1/5 درصد ران شدند.
نتیجه و بحث:
هدف از این مطالعه ایجاد یک روش براي کشت سلولهاي اپی تلیال اتندومتریوم براي مطالعات کشت جنین با سلولهاي اندومتریوم و آنالیز برهمکنش هاي جنین با این سلولها در مرحله بعد از لانه گزینی جنین بود. چندین مطالعه دیگر از سلول هاي گرانولوزا ، کومولوس، اندومتریوم و اویداکت براي بررسی هم کشتی جنین با این سلولها استفاده کردند - . - 5 تسوجی و همکاران اثر استرادیول و پروژسترون را در هم کشتی سلولهاي جنینی با سلولهاي اپی تلیال اندومتریوم رت - Rat - بررسی کردند - . - 5 فرانزاك و همکاران نشان دادند استروژن ترشح شده در میومتریوم و بعنوان یک سیگنال تنظیم کننده آبستنی عمل می کند - . - 6 نتایج این تحقیق تفاوتی در بیان ژنهاي IGF-I وIGF-II در بین تمام تیمارها نشان نداد - شکل . - 2 بیان این دو ژن ممکن است تحت تاثیر این هورمون نباشد اما مطالعات اخیر نشان داده اند که هورمون هاي استروئیدي رسپتور هسته اي دارند و می توانند بطور مستقیم در بیان ژنها تاثیر
