بخشی از مقاله
چکیده
به منظور تعیین ترادف کامل ویروس کوتولگی زرد جو - BYDV-PAV - در ایران، جدایهاي از منطقه اسفندقه - از استان کرمان و با کد - 1149-final که داراي علائم آلودگی به ویروس مذکور بود انتخاب شد. جهت تائید وجود ویروس در گیاه از آزمونهاي enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA - و tissue print immuno assay - TPIA - استفاده گردید. . استخراج آر. ان. اي کل از بافت گیاهی آلوده به ویروس با استفاده از کیت - شرکت سیناژن - RNX - -plus - TM انجام شد.
با استفاده از نه جفت آغازگر اختصاصی PAV با روش RT-PCR کل ژنوم ویروس تکثیر شد. قطعه هاي تکثیر شده با استفاده از - MBI Fermentas - Ins T/A clone PCR Product Cloning Kit در پلاسمید PTZ57R/T وارد و در سویه DH5α باکتري Escherichia coli همسانه سازي گردید. آنالیز ترادف نوکلئوتیدي نشان داد که جدایه ایرانی ویروس کوتولگی زرد جو - BYDV-PAV - با %94 در صد تشابه با جدایههاي AF235167 - از ایلی نویز - و EF043235 - از آمریکا - در یک گروه قرار میگیرند در حالیکه در صد تشابه این جدایه با سایر جدایههاي موجود در بانک ژن کمتر از %90 میباشد و کمترین در صد تشابه آن با جدایه AY855920 از چین - %77 - میباشد، است.
مقدمه
ویروس هاي عامل کوتولگی زرد از مهمترین عوامل خسارت زا در غلات می باشند و از عوامل محدود کننده کشت این محصولات دردنیا به شمار می روند 7 - و . - 10 این گروه از ویروس ها متعلق به تیره Luteoviridae می باشند که با شته به صورت پایا - گردشی و غیر تکثیري - منتقل میشوند 4 - ، 5 و . - 13 این ویروس ها داراي گسترش جهانی و دامنه میزبانی وسیع شامل 150 گونه زراعی و غیر زراعی از تیره Poaceae می باشند .
پیکره این ویروس ها ایزومتریک و به قطر 25 نانومتر و ژنوم آنها آر. ان . اي تک لاي مثبت می باشد. این ویروس ها محدودبه بافت آبکشی هستند وبه روش مکانیکی یا از طریق بذر منتقل نمیشوند. 7 - ، 11، 14 و . - 15 مهمترین علائم بیماري شامل کوتولگی ناشی از کاهش فاصله میانگرهها و تغییر رنگ برگها به زرد یا ارغوانی میباشد که از نوك برگها آغاز شده و سرانجام کل برگ را فرا میگیرد - . - 7 به دلیل اهمیت اقتصادي ویروس هاي مولد کوتولگی زرد غلات تحقیقات وسیعی در سطح جهان درموارد مختلفی همچون انتقال ، دامنه میزبانی ، انتشار ، اپیدمیولوژي، تاکسونومی ناقلین و روش هاي کنترل انجام شده است.
- 8 - کاربردي ترین و اقتصاديترین روش کنترل این ویروس ها ، استفاده از واریته هاي مقاوم و متحمل به ویروس ها و یا ناقلین آنها است اما باتوجه به محدودیت منابع ژنهاي مقاومت درطبیعت به نظر میرسد که استفاده از گیاهان ترانس ژنیک، که ژنهاي خاصی را بیان می کنند، می تواند جایگزین مناسبی باشد. درحال حاضر درسراسر دنیا تعیین ترادف ژنوم این ویروسها به منظورهاي مختلف از جمله زمینه سازي براي وارد کردن ژنهاي بیمارگر به ژنوم گیاه در جریان است - 3 و . - 12 اولین بار ایزدپناه و همکاران درسال زراعی1368 -69 آلودگی به این ویروسها را در مزارع پنجمﲔ ﳘایش ملی بیوتکنولوژي ﲨهوري اسلامی ایران 3-5 آذر ماه 1386، سالن اجلاس سران ایران مشاهده و گزارش کردند.
- 2 - بررسیهاي انجام شده توسط افشاریفر و همکاران بر روي ویروسهاي کوتولگی زرد جو - BYDVs - و کوتولگی زرد غلات - CYDV - نشان داد که این ویروسها در ایران گسترش وسیعی دارند و در اکثر مناطق، غالب بودن سروتیپ PAV تشخیص داده شد . - 1 - با اینکه این ویروسها اهمیت زیادي در ایجاد خسارت و کاهش محصول در مزارع کشور دارند اما اطلاعی از ترادف کامل آنها در دست نمیباشد. در تحقیق حاضر به منظور دستیابی به ترادف کامل این ویروسها جدایهاي از منطقه اسفندقه انتخاب و مطالعات روي آن انجام شد.
مواد و روشها
طی بازدیدهاي به عمل آمده، نمونه هاي گیاهی شامل گندم، جو،یولاف و علف هرز که حاوي علائم ویروس از قبیل کوتولگی بوته و زردي و قرمز شدن برگها بودند جمع آوري شدند. جهت تعیین آلودگی در نمونهها از آزمونهاي - 9 - Tissue Print Immuno Assay - TPIA - و - 6 - Indirect-ELISA استفاده شد. پس از مشخص شدن نمونههاي آلوده، گیاه جو آلوده به ویروس منطقه اسفندقه جهت انجام مطالعات بعدي انتخاب شد. براي تهیه آر.ان.اي مورد نیاز جهت آزمون RT-PCR از کیت جداسازي آر.ان.اي RNXTM - - Plus - شرکت سیناژن استفاده شد. پس از تهیه cDNA، براي هر جفت آغازگر با برنامه مشخص PCR انجام شد.
از محصول PCR براي همسانهسازي وتعیین ترادف استفاده شد و به طور مستقیم در ناقل PTZ57R/T با استفاده از - InsT/AClone PCR Product Cloning Kit - Fermentas وارد شد. حداقل دو تکرار از هر نمونه با آغازگرهاي M13 مستقیم ومعکوس خوانده و تعیین ترادف شدند. پس از تعیین ترادف،سکانسهاي بدست آمده با استفاده از برنامه Blast با ترادفهاي موجود در GenBank مقایسه شدند و ارتباط آنها باBYDV-PAV تأیید گردید و با استفاده از نرم افزار vector NTI - version 9.0.0 - از تمام قطعات contig به طول 5668 جفت باز ساخته شد.
نتیجه و بحث
پس از انجام آزمون RT-PCR با استفاده از 9 جفت آغازگر اختصاصی، تعیین ترادف و مرتب نمودن ترادفها، قطعهاي با طول 5668 جفت باز بدست آمد که حدود 5180 جفت باز آن کد کننده و 488 جفت باز آن در انتهاي 3΄ ژنوم غیر کد کننده می- باشد. همانطور که در جدول و درخت فیلوژنتیکی مشاهده میشود، مقایسه ترادف بدست آمده با سایر ترادفهاي موجود در بانک ژن در سطح نوکلئوتیدي نشان داد که جدایه ایرانی ویروس کوتولگی زرد جو - BYDV-PAV - ، - 1149-final - ، با %94 در صد تشابه با جدایههاي AF235167 - از ایلی نویز - و EF043235 - از آمریکا - در یک گروه قرار میگیرند در حالیکه در صد تشابه این جدایه با سایر جدایههاي موجود در بانک ژن کمتر از %90 میباشد و کمترین در صد تشابه آن با جدایه AY855920 - از چین - که %77 میباشد، است.
