بخشی از مقاله
چکیده
تحقیق حاضر به منظور بررسی توالییابی ژن BMP15 از خانواده فاکتور رشد تغییر شکل دهنده بتا - TGF-β - که در کنترل توسعه فولیکول در تخمدان، نرخ تخمکگذاري و باروري نقش حیاتی دارد طرح و اجرا گردید. نمونهها از 91 بز نجدي مربوط به 3 موقعیت جغرافیایی، شمال غربی، جنوب شرقی و مرکز استان خوزستان به طور تصادفی انتخاب شدند. و بعد از استخراج DNA، تکثیر قطعه 235 جفت بازي از اگزون 2 ژن BMP15 با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی انجام گرفت. بعد از تکثیر قطعات مورد نظر توالییابی شدند. نتایج حاصل از توالییابی با نرمافزار Vector NTI مورد بررسی قرار گرفت، نتایج حاصل از این نرمافزار سه جهش در باز 529 از نوع T به G و در باز 530 از نوع C به G و در باز 576 از نوع T به C را مشخص نمود.
کلمات کلیدي: ژن BMP15، بز نجدي، توالییابی، نرخ تخمک گذاري، PCR
مقدمه
در حوزه ژنتیک و اصلاح، اطلاع از ساختار ژنتیکی جمعیتها میتواند کمک بزرگی براي برنامهریزي طرحهاي اصلاح نژادي و از همه مهمتر، حفظ ذخایر ژنتیکی باشد. بز نجدي یکی از انواع نژادهاي بز میباشد که متعلق به استانخوزستان است. در این استان بیش از 1750000 رأس بز وجود دارد که آمار دقیقی از بز نجدي در دست نیست چون به شدت با نژادها، آمیخته شده است. دفعات زایمان این نژاد دو بار در سال بوده و اغلب بزهاي نجدي و بومی استانخوزستان از جمله بزهاي چندقلوزاي کشور هستند که میزان چندقلوزایی در بین آنها به ترتیب 46 و 20 درصد است - حاجیسیدجوادي و همکاران،. - 1388 مطالعات ژنتیکی در چند نژاد اروپایی نشان دادهاند که نرخ تخمک ریزي و چندقلوزایی به وسیله عمل ژنهاي منفردبزرگ اثر تعیین میشود.
بنابراین، دو فاکتور کلیدي شناخته شده فاکتور تمایز رشد شماره - GDF-9 - 9 و پروتئین مورفوژنتیک استخوان شمار - BMP-15 - 15 میباشند که دو عضو فوق خانواده فاکتور رشد تغییر شکل دهنده بتا- - TGFβ - هستند - گالوري و همکاران، 2000 و هنراهان و همکاران، . - 2004 این فاکتورهاي رشد اووسیتی براي پیشرفت مراحل اولیه فولیکول سازي و سپس در تکامل پایانی فولیکول بسیار حیاتی هستند - دانگ و همکاران، 1996 و گالوري و همکاران،. - 2000 این فاکتورهاي ترشح شده اووسیت، نقش مهمی در تمایز سلولهاي گرانولوزاي فولیکول تخمدانی - اپیگ، 2000 ولی و همکاران، - 2000 و تنظیم اعمال کلیدي این سلولها دارند - الوین و همکاران، 1999و جویس و همکاران، 2000 و اتسکاو همکاران، . - 2001 پنج جهش به طور طبیعی در ژن BMP-15 شناسایی شدهاند. mRNAها و پروتئینهاي BMP-15 وGDF9 در فولیکولهاي تخمدان بز در مراحل تکامل آنها بیان میشوند - سیلوا و همکاران، . - 2004 هدف از این پژوهش تعیین توالی ژن BMP15 در بزهاي نجدي با استفاده از تکنیک PCR بوده است.
موادشوشروشها
خونگیري با استفاده از لولههاي خلا دار 4 میلی لیتري حاوي ماده ضد انعقاد EDTA از سیاهرگ وداج گردن 91 بز نجدي مربوط به 3 موقعیت جغرافیایی استان خوزستان انجام گرفت و نمونهها در داخل یخ به آزمایشگاه مرکزي دانشگاه کشاورزي و منابع طبیعی رامین منتقل شدند. طی مدت استخراج، DNA نمونهها در دماي -20 درجه سانتیگراد در آزمایشگاه نگهداري شدند. استخراج DNA با استفاده از کیت DIATOM - شرکت سینا ژن - انجام شد. براي تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده از روش الکتروفورز روي ژل آگارز استفاده شد. آغازگرها از شرکت تکاپوزیست ایران و به صورت لیوفیلیزه غیرحساس به دما دریافت و طبق دستورالعمل کارخانه سازنده با آب دو بارتقطیر رقیق و در دماي -20 درجه سانتیگراد نگهداري شدند.
واکنش زنجیرهاي پلیمراز براي تکثیر قطعه 235 جفت بازي جایگاه ژنی BMP15 با 35 چرخه95 - درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه براي واسرشت و 56 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه براي اتصال، 72 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه براي بسط - در دستگاه ترموسایکلر انجام گرفت و محصولات PCR روي ژل آگارز الکتروفورز شدند.مشخصات آغازگر مورد استفاده F: 5’ TACAGACCCTGGACTTTCCTCT-3’ و R: 5’-GCCCAACATGTTCCATGATATCC-3’ است. بعد از فرآیند PCR براي تعیین ژنوتیپها از روش SSCPاستفاده شد. براساس الگوي باندي مشاهده شده نمونه جهت توالییابی به شرکت سینا ژن فرستاده شد. سپس نتیجه توالییابی به وسیله نرمافزار Vector NTI بررسی گردید.
نتایج و بحث
در این تحقیق براي اولین بار اگزون 2 ژن BMP15 در نژاد نجدي مورد توالییابی قرار گرفت. طول این ژن 235 bp تعیین گردید. محصولات PCR جهت اطمینان از صحت تکثیر روي ژل آگارز یک درصد بارگذاري شدند و نتایج الکتروفورز محصولات PCR نشان داد که قطعه مورد نظر به صورت اختصاصی تکثیر یافته و هیچ گونه باند غیر اختصاصی درالکتروفروز دیده نشد. 7 نمونه از محصولات PCR جهت توالییابی به شرکت سینا ژن فرستاده شد، با هم تراز سازي توالی-هاي بزهاي نجدي با توالهاي گرفته شده از GenBank و آنالیز دادهها به وسیله نرمافزار Vector NTI، مشخص شد که
نتایج حاصل از این نرمافزار سه جهش در جایگاه 529 نوکلئوتید تیمین - T - جایگزین گوانین - G - و در جایگاه 530نوکلئوتید سیتوزین - C - جایگزین گوانین - G - و در جایگاه 576 نوکلئوتید تیمین - T - جایگزین سیتوزین - C - شدند.
اینجهشها براي اولین بار در بز نجدي شناسایی شد. در این تحقیق از پرایمر طراحی شده براي گوسفند استفاده شد. و نتیجه سکانس با توالیهاي بز موجود در NCBI یکسان بود، ولی با توالیهاي گوسفند موجود در NCBI سه جهش نام برده راداشت - شکل 1 و . - 2وانگ و همکاران - 2011 - براي ژن BMP15 در دو نژاد بز چینی چهار جهش از نوع T به G، C به G، T به C و C به T را مشخص نمود. در بز مرخز در اگزون 2 ژن BMP15 در باز 573 جهش از نوع G به A و در باز 755 از نوع T به G را شناشایی کردند - هوراد قریشی و همکاران، . - 1389 براي ژن BMP15 در دو نژاد بز چینی چند شکلی مشاهده کردند ونشان دادند افزایش باروري نیز به دلیل این ژن بوده است همچنین با نتایج سلیمانی و همکاران - 1390 - که نشان دادند ژن BMP15 روي گوسفند سنجابی داراي جهش میباشد مطابقت دارد.
ولی با نتایج دلدار و همکاران - 2009 - با روش PCR-RFLP جهش در ژن BMP15 در چند نژاد بز ایرانی مشاهده نکردند، با نتایج علینقیزاده و همکاران - 1389 - با روش PCR-RFLP جهش در ژن BMP15 در بز سرخ جبال بارز نیافتند، هووا و همکاران - 2007 - در بزهاي چینی، چند شکلی براي ژنهاي اصلی FecB و FecX گزارش نشده است مطابقت ندارد. نتایج حاصل از این پژوهش با نتایج عارف نژاد و همکاران - 2007 - در بزهاي مرخز ایران چند شکلی در ناحیه کد کننده ژن BMP15 با روش PCR-SSCP و PCR-RFLP با آنزیم برشی Dde I یافت نشد، و با نتایج هی و همکاران - 2006 - جهشی در ژن BMP15 براي شش نژاد بزچینی گزارش نکردند، با نتایج نجاتی جوارمی و همکاران - - 2007 با روش PCR-SSCP جهشی در گوسفندان لري-بختیاري پیدا نکردند مطابقت ندارد.
