بخشی از مقاله
چکیده
بکارگیري فناوريهاي مولکولی، منجر به کشف جهشهاي با اثر عمده بر بازدهی تولید و مثلی در گوسفند و بز شده است. بیشتر این جهشها در ژنهاي BMP15، GDF9 و booroola یافت شدهاند. در ژن GDF9 جهشهاي FecGH و FecTT چنین اثري دارند. تحقیق حاضر به منظور بررسی توالییابی ژن GDF9 از خانواده فاکتور رشد تغییر شکل دهنده بتا - TGF-β - که در کنترل توسعه فولیکول در تخمدان، نرخ تخمکگذاري و باروري نقش حیاتی دارد طرح و اجرا گردید.
نمونهها از 91 بز نجدي مربوط به 3 موقعیت جغرافیایی، شمال غربی، جنوب شرقی و مرکز استان خوزستان به طور تصادفی انتخاب شدند. و بعد از استخراج DNA، تکثیر قطعه 295 جفت بازي از اگزون 2 ژن GDF9 با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی انجام گرفت. بعد از تکثیر قطعات مورد نظر توالییابی شدند. نتایج حاصل از توالییابی با نرمافزار Vector NTI مورد بررسی قرار گرفت، نتایج حاصل از این نرمافزار دو جهش در باز 2045 از نوع T به C و در باز 2053 از نوع C به A را مشخص نمود.
مقدمه
نرخ تخمکریزي یکی از سازههاي مهم در تعیین بازدهی تولیدمثلی است. در گونههاي مختلف پستانداران، گونادوتروپینها، هورمونهاي متابولیکی و فاکتورهاي رشد پاراکرینی، گامههاي فولیکولسازي و تخمکریزي را کنترل میکنند - هانتر و همکاران، . - 2004 به تازگی یافتههاي بسیاري نشان دادهاند که فاکتورهاي پاراکرین تراوش شده بهوسیله اووسیت، عملکردهاي - تکثیر استرویید سازي، تمایز و مرگ و میر یاختهاي - یاختههاي سوماتیک فولیکولی را تنظیم میکنند
هنگام تکامل برون تنی، فاکتورهاي تراوش شده به وسیله اووسیت، به ویژه GDF9 وBMP15، با اثر بر عملکرد یاختههاي کومولوس، نرخ نمو اووسیت را افزایش میدهند. ابرخانواده فاکتور رشد تبدیل کننده بتا - TGF-β - ، داراي 35 عضو است. نشان داده شده است که بسیاري از آنها در تنظیم باروري مهم هستند
جهشهاي طبیعی در نژادهاي گوسفند بارور نشان دادهاند که لیگاندهاي ابر خانواده TGF-β، مانند GDF9 و BMP15 و گیرنده آنها - BMPR1B - در فرآیند تخمکگذاري و افزایش باروري نقش مهمی ایفا میکنند. در گوسفندهاي داراي ژنهاي GDF9 و BMP15، شمار کل فولیکولهاي داراي فعالیت استروژنی بیشتر از تیپ وحشی بود
جهشهایی که نرخ تخمکریزي را افزایش میدهند در ژنهاي BMPR-1B و GDF9 دیده شدهاند - دیویس، . - 2004 اثر جهش GDF9 بیشتر از اثر جهش BMP15 است، به گونهاي که یک کپی از FecGH در نژادهاي Cambridge و Belcare نرخ تخمکریزي را به میزان 1/4 تخمکریزي در هر چرخه فحلی افزایش میدهد
میشهاي هتروزایگوت داراي جهش در هر دو ژن، بارور هستند و اثر این دو جهش افزایشی است، اهمیت GDF9 و BMP15 در نمو فولیکولی تخمدان بز، با بررسی بیان ژنهاي آنها بررسی شد. ولی تاکنون پژوهشهاي اندکی درباره ژنهاي اصلی موثر بر باروري و تخمکریزي در این گونه انجام شده است. هدف از این پژوهش تعیین توالی ژن GDF9 در بزهاي نجدي با استفاده از تکنیک PCR بوده است.
مواد و روشها
خونگیري از سیاهرگ وداج گردن 91 بز نجدي مربوط به 3 موقعیت جغرافیایی استان خوزستان انجام گرفت. استخراج DNA با استفاده از کیت DIATOM - شرکت سینا ژن - انجام شد. براي تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده از روش الکتروفورز روي ژل آگارز استفاده شد. آغازگرها از شرکت تکاپوزیست ایران دریافت و طبق دستورالعمل کارخانه سازنده با آب دو بارتقطیر رقیق شدند. سپس واکنش زنجیرهاي پلیمراز با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی بر اساس توالی پیشنهادي Chu و همکاران - 2011 - صورت گرفت
واکنش زنجیرهاي پلیمراز براي تکثیر قطعه 295 جفت بازي جایگاه ژنی GDF9 با 35 چرخه 95 - درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه براي واسرشت و 59 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه براي اتصال، 72 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه براي بسط - در دستگاه ترموسایکلر انجام گرفت و محصولات PCR روي ژل آگارز الکتروفورز شدند. بعد از فرآیند PCR براي تعیین ژنوتیپها از روش SSCP استفاده شد.
براساس الگوي باندي مشاهده شده نمونه جهت توالییابی به شرکت سینا ژن فرستاده شد. سپس نتیجه توالییابی به وسیله نرمافزار Vector NTI بررسی گردید.
جدول -1 توالی آغازگرهاي مورد استفاده
نتایج و بحث
محصولات PCR جهت اطمینان از صحت تکثیر روي ژل آگارز یک درصد بارگذاري شدند و نتایج الکتروفورز محصولات
PCR نشان داد که قطعه مورد نظر به صورت اختصاصی تکثیر یافته و هیچ گونه باند غیر اختصاصی در الکتروفروز دیده نشد
تجزیه حاصل از الکتروفروز با استفاده از روش PCR-SSCP منجر به شناسایی 3 فرم مختلف از الگوي باندي براي بزهاي نژاد نجدي موقعیتهاي جغرافیایی مختلف شد. در نتیجه، 3 نمونه از محصولات PCR جهت توالییابی به شرکت سینا ژن فرستاده شد، با هم تراز سازي توالیهاي بزهاي نجدي با توالهاي گرفته شده از GenBank و آنالیز دادهها به وسیله نرمافزار Vector NTI، مشخص شد که در دو نمونه در جایگاههاي 2045 و 2053 جهش تک نوکلئوتیدي وجود دارد. با بررسی نموداري مشخص شد که در جایگاه 2045 نوکلئوتید سیتوزین - C - جایگزین تیمین - T - و در جایگاه 2053 نوکلئوتید آدنین - A - جایگزین سیتوزین - C - شدند.
شکل -1 محصولات پی. سی. آر - قطعه 295جفت بازي - بر روي ژل آگارز 1درصد
نتایج حاصل از این پژوهش با نتایج چو و همکاران - 2011 - مطابقت دارد آنها در پنج نژاد بز چینی نیز دو جهش از نوع C به A و T به C گزارش کردند. در بز مرخز در اگزون 2 ژن GDF9 در باز 452 جهش از نوع C به T را گزارش کردند
محقق دیگري در بز نژاد بیتال در جایگاه 520 bp جهش تک نوکلئوتیدي از نوع C به T را گزارش کردند
نتایج به دست آمده از تحقیق حاضر با نتایج رحیمی و همکاران - 1392 - با روش SSCP براي اگزون 2 ژن GDF9 در دو نژاد گوسفند بهمئی و لک قشقایی، که در نژاد بهمئی سه الگوي متفاوت A، B و C و در نژاد لک قشقایی دو الگوي A و B مشاهده کردند و با نتایج بادبرین و همکاران - 1392 - با روش RFLP براي ژن GDF9 در گوسفند نژاد قره گل سه الگوي AA، BB و AB مشاهده کردند مطابقت دارد.
با نتایج سلیمانی و همکاران - 1389 - در گوسفند سنجابی در ناحیه کد کننده ژن GDF9 با روش PCR-SSCP جهش مشاهده کردند همچنین چو و همکاران - 2011 - در پنج نژاد بز چینی با روش PCR-SSCP در ناحیه کد کننده ژن GDF9 سه ژنوتیپ AA، AB و BB گزارش کردند، با نتایج بهمنی و همکاران - 1389 - در ژن GDF9 روي گوسفند قرهگل با روش PCR-SSCP جهش مشاهده کردند مطابقت دارد. فرجزاده و همکاران - - 1386 در گوسفند آرخامرینوس در ژن GDF9 همچنین خاتمینژاد و همکاران - 1390 - در ژن GDF9 در بز آلپاین با روش PCR-RFLP و غفاري و همکاران - 2007 - در ژنهاي GDF9 در گوسفند شال، چند شکلی یافت نشد مطابقت ندارد.
