بخشی از مقاله
چکیده
چندقلوزایی یکی از صفات مهم اقتصادي در گوسفند میباشد که تحت تأثیر محیط و ژنتیک بوده و افزایش آن با سودمندي اقتصادي همراه است. بنابراین افزایش درصد دوقلوزایی از دیدگاههاي موجود در بهبود صفات اقتصادي است. یکی از ژنهاي کاندیدا براي چندقلوزایی پروتئین GDF9 - فاکتور رشد و تمایز - 9 است. پروتئین GDF9 یک فاکتور رشد براي سلولهاي گرانولوزا و میتواند به عنوان کنترلکننده رشد سلولهاي کومولوس و تمایزدهنده سلولهاي گرانولوزا باشد.
ژن GDF9 داراي دو اگزون و یک اینترون به طول 1126 جفت باز بوده که جهشهاي رخ داده در این ژن بر روي تولیدمثل تاثیرگذار می باشد. هدف از این تحقیق تعیین توالی اگزون شماره 2 ژنGDF9 گوسفندان عربی و بهمئی و اثرات جهش تک نوکلئوتیدي بر ساختار و عملکرد پروتئین با استفاده از روشهاي بیوانفورماتیکی بود. نمونه¬هاي خون از تعداد 50 رأس گوسفند عربی ایستگاه تحقیقاتی دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی خوزستان و 35 رأس گوسفند بهمئی از ایستگاه تحقیقاتی بهمئی جمع¬آوري شد.
پس از استخراج DNA، یک قطعه 1069 جفت بازي از اگزون شماره 2 ژن GDF9 تکثیر شد. سپس نمونه¬ها با کمک شرکت BIONEER کره جنوبی توالی¬یابی شدند. توالی¬ ای بدست آمده توسط نرم افزار bio Edit پردازش و با کمک وب سایت NCBI همردیف گردیدند.
پس از آنالیز داده ها مشخص شد که تغییري در توالی نوکلئوتیدي GDF9 گوسفند عربی رخ نداده است اما در گوسفند بهمئی یک جهش تک نوکلئوتیدي مشاهده شد. این جهش سبب شده که نوکلئوتید آدنین - A - جایگزین سیتوزین - C - شود. پس از ترجمه توالی DNAي حاوي جهش به توالیهاي پروتئینی، و مقایسه آن با توالی مرجع ثبت شده در NCBI مشخص شد این جهش تغییري در ساختمان سوم پروتئین ایجاد نمی کند و از نوع جهش خاموش می باشد.
مقدمه
در سال¬هاي اخیر بهبود صفات تولیدمثلی در گوسفند توسط تولیدکنندگان مورد توجه زیادي قرار گرفته است. از جمله این صفات تعداد نتاج در هر زایش است که سودمندي مزارع پرورش گوسفند به طور عمده¬اي تحت تأثیر تعداد فرزندان قرار می-گیرد. علاوه بر دامپروران، متخصصین اصلاح نژاد نیز استفاده از حیوانات چندقلوزا را نسبت به حیوانات تک قلوزا ترجیح می¬دهند. همچنین امکان تکثیر ژن خارجی هدف در حیوانات تراریخته چندقلوزا نسبت به تک قلوزاها زیادتر بوده و به همین دلیل استفاده از حیوانات چند قلوزا به خصوص دام¬هاي اهلی مورد توجه متخصصین اصلاح نژاد است
از ژنهاي موثر بر نرخ تخمگذاري می توان ژن GDF9 را نام برد. که عضو خانواده بزرگ TGF-β است. این ژن جزو ژنهاي اتوزومی با اثر غلبه ماورائی است که روي کروموزوم شماره 5 گوسفند قرار گرفته است
توالی نوکلئوتیدي ژن GDF9 را گزارش کردند. طول این ژن در حدود 2/5 کیلوباز است که داراي دو اگزون که توسط یک اینترون 1126 بازي از هم جدا میشوند. این ژن یک پروتئین بالغ 135 اسیدآمینهاي را کد میکند. GDF9 یک فاکتور رشد براي سلولهاي گرانولوزا و میتواند به عنوان کنترلکننده رشد سلولهاي کومولوس و تمایزدهنده سلولهاي گرانولوزا باشد
به طور کلی تأثیر جهش GDF9 در گوسفند ممکن است براي افزایش حساسیت فولیکول تخمدانی به FSH باشد و بدین وسیله باعث افزایش نرخ تخمکگذاري میشود. GDF9 به طور منحصر به فرد در تخمدان موشهاي بالغ بیان میشود و همچنین یک محرك قوي براي تکثیر سلولهاي گرانولوزا در موش است
چند شکلی در ژن GDF9 را شناسایی کردند که تنها یکی از آنها - G8 - بر افزایش نرخ تخمکگذاري و چندقلوزایی در گوسفند موثر شناخته شد. این جهش براي اولین بار در دو نژاد کمبریج و بلیکلر باعث جایگزینی باز تیمین به جاي باز سیتوزین در جایگاه 1184 توالی کدکننده این ژن میگردد و در نتیجه اسیدآمینه فنیلآلانین جایگزین سرین میگردد. برآورد شده است که این جهش نرخ تخمکگذاري را در میشهاي هتروزیگوت جهشیافته افزایش و در میشهاي هموزیگوت سبب ناباروري میشود
هدف از این پژوهش تعیین توالی و تشخیص جهش هاي جدید اگزون 2 ژن GDF9 در گوسفندان نژاد عربی و بهمئی و اثرات این جهشها بر ساختار سوم پروتئین با نرم افزارهاي بیوانفورماتیکی بود.
مواد و روشها
جهت انجام این تحقیق نمونه هاي خون از 50 رأس گوسفند عربی - ایستگاه تحقیقاتی دانشگاه علوم کشاورزي و منابع طبیعی خوزستان - از شهرستان باوي و تعداد 35 گوسفند بهمئی از شهرستان بهمئی واقع در جنوب غربی استان کهگیلویه و بویراحمد تهیه شد. نمونه¬هاي خون کامل از سیاهرگ وداج گردن و با استفاده از لوله خلاء دار 5 میلی¬لیتري حاوي ماده ضد انعقاد EDTA تهیه گردید و در داخل یخ به آزمایشگاه مرکزي دانشگاه کشاورزي و منابع طبیعی رامین منتقل و تا زمان استخراجDNA در فریزر دما 20– درجه¬ سانتیگراد نگهداري شد.
استخراج DNA با استفاده از کیت شرکت تجهیز آزما انجام شد. براي تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده از دو روش اسپکتوفتومتري - تعیین غلظت DNA با دستگاه نانودراپ - و الکتروفورز روي ژل آگارز استفاده شد. در این مطالعه وجود جهش در اگزون شماره 2، ژن GDF9 مورد بررسی قرار گرفت. آغازگرها از شرکت تجهیزآزما و به صورت لیوفیلیزه - غیر حساس به دما - دریافت و طبق دستورالعمل کارخانه سازنده با آب دو بار تقطیر رقیق شدند. براي انجام واکنش PCR، از آغازگرهاي پیشرو و پیرو با توالی نوکلئوتیدي زیر استفاده گردید. طول آغازگر رفت 22 و براي برگشت 21 نوکلئوتید بود.
برنامه حرارتی براي تکثیر ژن GDF9 شامل: دماي واسرشت شدن اولیه 94 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، 35 سیکل با دماي با دماي واسرشت 94 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، اتصال پرایمرها 53/8 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، تکثیر قطعه مورد نظر 72 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه و یک سیکل دماي تکثیر نهایی 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه بود. از مجموعه کیت PCR Master Kit شرکت ژن فناوران براي انجام واکنش PCR استفاده شد.
غلظت¬هاي مورد استفاده از مواد بعد از بهینه سازي براي انجام PCR به ترتیب 0/75 میکرولیتر MgCl2، 2/5 میکرولیتر بافر PCR 10X، 0/5 میکرولیتر dNTP، 0/75 میکرولیتر پرایمر رفت، 0/75 میکرولیتر پرایمر برگشت، 0/4 واحد Taq DNA Polymerase، 2 میکرولیتر DNA ژنومی و مابقی را تا رسیدن به 25 میکرولیتر از آب مقطر استفاده شد. سپس نمونه¬ها با کمک شرکت BIONEER کره جنوبی توالی¬یابی شدند. توالی ¬هاي بدست آمده توسط نرم افزار bio Edit پردازش و با کمک وب سایت NCBI بلاست گردیدند.
نتایج و بحث
گام نخست در اجراي تکنیکهاي مهندسی ژنتیک و بیوتکنولوژي دسترسی به ماده ژنتیک است. استخراج DNA اولین و مهمترین نیاز در اجراي تحلیلهاي ژنتیکی است. استخراج DNA از نمونههاي خون به کمک کیت حیوانی شرکت تجهیزآزما انجام گرفت. استخراج پژوهشهاي ژنتیک مولکولی با هدف خاص در صورتی موفق خواهند بود که آغازگر خوب و با کیفیت طراحی شود.
بنابراین صرف وقت و دقت در انتخاب و طراحی آغازگر کیفیت کار مولکولی را افزایش میدهد. الکتروفورز محصولات تکثیر شده روي ژل آگارز 2 درصد، از جایگاه ژن GDF9 نشان داد که قطعه 1069 جفت بازي در نظر گرفته شده به خوبی و بدون باند غیر اختصاصی تکثیر یافته است. در این مطالعه نشانگر مولکولی مورد استفاده 100 جفت بازي و متعلق به شرکت سیناژن بود. نتیجه الکتروفورز DNA استخراج شده و قطعه 1069 جفت بازي تکثیر شده از ژن GDF9 در شکل 1 نشان داده شده است.
شکل -1 محصولات PCR ژن GDF9 بر روي ژل آگارز 2 درصد.
