بخشی از مقاله
مقدمه
لکتین متصل شونده به مانوز (MBL) یکی از اجزاي مهم در ایمنی ذاتی است که توسط هپاتوسیت ها در کبد تولید می شود. MBL جزء خانواده کالکتین ها بوده و براي عملکرد خود نیاز به حضور کلسیم در محیط دارد 5)و. (6
MBL در فعال سازي سیستم کمپلمان از مسیر لکتین نقش دارد و براي این کار، از یک طرف به قند موجود در دیواره خارجی میکروارگانیسم ها، و از طرف دیگر به سرین پروتئازهایی به نام MASP متصل می شود. پس از این اتصال، MBL که نقشی همانند مولکول C1q در مسیر کلاسیک کمپلمان دارد (2)، موجب راه اندازي آبشار فعال سازي کمپلمان می شود و از این طریق باعث حذف میکروارگانیسم مهاجم می شود(6 و .(9 به طور کلی مولکول MBL که هوموتریمري از زیر واحد هاي مشابه است، از بخشهاي زیر تشکیل می شود: دمین متصل شونده به کربوهیدارت (CRD) در پایانه C ، ناحیه خمیده، ناحیه کلاژنی و یک ناحیه غنی از سیستئین در پایانه 8) N و (10 (شکل .(1 وقوع برهمکنشهاي هیدروفوبیک و پیوندهاي دي سولفیدي، به خصوص در پایانه N، کمک زیاد به پایداري مولکول MBL می کند.
شکل -1 نمایی کلی از MBL و دمین CRD
پروتئین MBL توسط ژن mbl2 واقع بر روي بازوي بلند کروموزوم10 (در موقعیت(10q11.2-q21، رمزگذاري می
شود و 4 اگزون دارد. MBL وزن مولکولی بین -700kDa 400 داشته و فرم فعال ان به صورت تترامر است(10 و .(11 از بین پلی مورفیسم هاي گوناگون موجود در اگزون
1 ژن mbl2، پلی مورفیسم در کدونهاي 52، 54 و 57 ،
بیشترین تأثیر را بر سطح سرمی این پروتئین دارد که به ترتیب با آلل هاي D ، B و C نشان داده می شوند. به علاوه، در موقعیت +4 در 5 ́UTR هم یک پلی مورفیسم گزارش شده است که در آن نوکلئوتید C (آلل (P به T
(آلل (Q تبدیل می شود. در کدون 52 ، نوکلئوتید C با T و
درکدونهاي 54 و 57 ، نوکلئوتید G با A جانشین می شود
3)، 5 و (9 (شکل .(2
در نتیجه این جابه جاییها، در کدون 52 امینو اسید ارژینین به سیستئین، در کدون 54 گلایسین به اسید اسپارتیک و در کدون 57 گلایسین به اسید گلوتامیک تبدیل می شود. به طور کلی، ژنوتیپ داراي جهش با O و حالت نرمال ژنوم، با A نشان داده می شود 6)، 7 و .(9
مواد و روشها
نمونه هاي خون: تعداد 143 فرد سالم داوطلب اهداي خون، وارد مطالعه شدند. سلامتی این افراد توسط پزشک و به وسیله انجام تستهاي غربالگري انتقال خون ایران تأیید شد. نمونه هاي خون در دو لوله گردآوري شد: یک لوله حاوي 5cc خون کامل به همراه EDTA براي استخراج
DNA ، و لوله دیگر حاوي 5cc خون کامل به همراه ژل سیلیکونی جدا کننده، به منظور جداسازي سرم از خون و تعیین سطح سرمی MBL توسط انجام تکنیک الایزا.
استخراج : DNA استخراج DNA از نمونه هاي خون ، به روش Salting-Out و به صورت دستی انجام شد. در این روش، ابتدا طی چند مرحله، با استفاده از محلولهاي لیز کننده و انجام سانتریفیوژ، سلولها لیز می شوند و عصاره سلولی به دست می آید. سپس با استفاده از آنزیم پروتئیناز
492
Functional MBL ELISA kit(ligand
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392
K هضم پروتئینهاي سلولی انجام می گیرد و به وسیله اتانول مطلق براي پاکسازي نمونه DNA استفاده می شود.
NaCl این پروتئینها رسوب داده می شوند، در نهایت از
Exon 1 5 ́UTR
+239 +230 +223 +4 nt pos:
A to C A to B A to D P to Q allele:
G to A G to A C to T C to T nt sub:
Gly57Glu Gly54Asp Arg52Cys aa Sub:
(G57E) (G54D) (R52C) 5 و معرفی آلل ها و نوکلئوتیدها در هر جایگاه (9)
شکل -2 نمایی از نفاط داراي پلی مورفیسم در اگزون 1 و ناحیه ي ترجمه نشونده ́ي
: PCR نمونه هاي DNA استخراج شده، با استفاده از یک جفت پرایمر اختصاصی اگزون 1، براي تکثیر کل اگزون - 256 نوکلئوتید- توسط تکنیک PCR تکثیر شدند. اطلاعات مربوط به پرایمر مورد استفاده، در جدول 1 آمده است.
پرایمر با استفاده از نرم افزار Primer 3 طراحی، و توسط شرکت سیناژن تولید شد. حجم کل محلول مورد استفاده براي تکثیر هر نمونه، 20µl در نظر گرفته شد که شامل این مواد بود: 0/5µl از هریک از پرایمرهاي بالا دست و پایین دست، MgCl2 0/8µl ، dNTP 0/5µl، 2/5µl بافر، 0/2µl
انزیم، 14µl اب و 1µl از نمونه ي DNA با غلظت . 2/1µg/µl تمام نمونه هاي DNA ابتدا براي جدا شدن دو رشته DNA به مدت دو دقیقه در 95 درجه سانتی گراد قرار گرفتند و پس از اتصال پرایمرها و شروع تکثیر DNA
در دماي 58 درجه سانتی گراد، مرحله گسترش محصولات
PCR به مدت 5 دقیقه در دماي 72 درجه سانتی گراد صورت پذیرفت. سپس براي اطمینان از انجام درست PCR
و حصول نتیجه، محصولات حاصل از PCR بر روي ژل آگارز 5 درصد با تکنیک الکتروفورز مورد ارزیابی قرار گرفتند (شکل.(3
تعیین توالی DNA هاي تکثیر شده: 143 نمونه DNA
حاصل از تکثیر توسط PCR، براي تعیین توالی و مشخص شدن نواحی چند شکل، به شرکت ماکروژن((macrogen
در کره جنوبی ارسال شدند. نتایج حاصل، توسط نرم افزار BioEdit آنالیز شده، و نقاط داراي چند شکلی مشخص شدند. تصاویري از گرافهاي حاصل از تعیین توالی و آنالیز
نتایج توسط نرم افزار BioEdit در شکلهاي 4 و 5 مشخص
است.
شکل -3 تصویر نمونه PCR شده بر روي ژل آگارز. دو باندي که در تصویر بالا در ناحیه حدود 300 کیلو بازي مشخص اند، حاصل تکرار یک نمونه اند. پایین ترین باند مربوط به DNA الگو در سمت چپ تصویر، 100 جفت باز طول دارد.
تعیین سطح سرمی : MBL براي تعیین سطح سرمی
MBL، ابتدا پلاسماي نمونه خون این افراد توسط سانتریفیوژ جدا شد و سپس به کمک کیت تشخیص MBL
توسط الایزا –
- elisa), Sanquin Reagents سطح سرمیMBL در هریک از این افراد مشخص شد. در این کیت الایزا، ابتدا مانان به عنوان سوبستراي MBL بر روي سطح میکروچاهکهایی قرار می گیرد و در مرحله بعد پلاسما به این چاهکها افزوده می شود. فرم فعال و تترامر MBL ، به وسیله HRP
493
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 26، شماره 4، 1392
متصل به آنتی بادي ضد MBL، شناسایی می شود و غلظت ان، با توجه به مقدار جذب نوري آن در 450nm، محاسبه می گردد.
آنالیزهاي اماري و محاسباتی: نتایچ پلی مورفیسم هاي به دست آمده و داده هاي مربوط به سطوح سرمی MBL ، به همراه اطلاعات مربوط به سن و جنس این 143 نفر، براي انجام آنالیزهاي آماري و ایجاد ارتباط منطقی بین داده ها، در نرم افزار SPSS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.
نتایج
در جمعیت مورد مطالعه، هیچ پلی مورفیسمی در موقعیت
+4 در 5 ́UTR دیده نشد. به عبارت دیگر، تمامی افراد در
این جایگاه داراي آلل P بودند. از این 143 نفر، 95 نفر
64/2) درصد) در هیچ یک از کدونهاي 52 ، 54 و 57 ،
چند شکلی نشان ندادند. 20 نفر 13/5) درصد) داراي پلی مورفیسم در کدون 52 (آلل (D بودند و 27 نفر (%18,2)
در کدون 54 (آلل (B پلی مورفیسم داشتند. در کدون 57 (آلل (C تنها یک مورد پلی مورفیسم به صورت هتروزیگوت مشاهده شد که این نتیجه از لحاظ آماري قابل استناد نیست. اطلاعات موبوط به نوع و فراوانی هریک از پلی مورفیسم هاي دیده شده، در جدول 2 قابل مشاهده است.
