بخشی از مقاله
جداسازي و شناسایی میکروفلوراي استخرهاي پرورشی و دستگاه گوارش میگوي سفید غربی (لیتوپنئوس وانامی) و ارزیابی آن ها به عنوان پروبیوتیک
چکیده
سابقه و هدف: امروزه پرورش میگو در اکثر کشورهاي استوایی رایج شده است. اما در حال حاضر بیماريهاي فراوانی پرورش میگوي سراسر جهان را تحت تاثیر قرار داده اند. عوامل عفونی باکتریایی مهم ترین معضل بهداشتی بیماري هاي میگوي پرورشی هستند. هدف از این پژوهش، جداسازي و شناسایی فلور باکتریایی آب پرورشی و دستگاه گوارش میگوي سفید غربی (لیتوپنئوس وانامی) در استخرهاي پرورشی استان بوشهر و بررسی آنها به عنوان پروبیوتیک می باشد.
مواد و روش ها: نمونه هاي میگو و آب 10 استخر پرورش میگوي استان بوشهر به آزمایشگاه منتقل شدند. نمونه هاي میگو کالبد
شکافی گردیدند. باکتري هاي جداسازي شده بر اساس آزمون هاي بیوشیمیایی، ریخت شناسی و نرم افزار بیولوگ شناسایی شدند. سپس با استفاده از دو روش چاهک گذاري و دیسک گذاري فعالیت ضدباکتریایی آن ها در برابر 6 باکتري بیماري زا ارزیابی گردید.
یافته ها: از آب پرورشی و دستگاه گوارش میگو 12 جنس مختلف از باکتري ها جداسازي شدند. بیشترین فراوانی باکتريهاي جداسازي شده مربوط به باسیلوس، ویبریو و سودوموناس بود. از بین جدایه ها باکتري هاي باسیلوس، میکروکوکوس و کورینه باکتریوم بیشترین اثر آنتاگونیستی را در برابر باکتري هاي پاتوژن مورد بررسی از خود نشان دادند.
نتیجه گیريتقریباً: تمام باکتري هاي جداسازي شده از دستگاه گوارش میگو در استخرهاي پرورشی نیز یافت شدند. باکتري هایی
مانند باسیلوس با تولید مواد ضدمیکروبی مانع رشد پاتوژن ها می شوند.
واژگان کلیدي: دستگاه گوارش، لیتوپنئوس وانامی، باکتري هاي بیماري زا.
دریافت مقاله: خرداد 1391 پذیرش براي چاپ: مرداد 1391
مقدمه
در بیست سال گذشته، صنعت آبزي پروري به ویـژه میگـو و ماهی به طور عظیمی رشد داشته است. سـازمان فـائو تخمیـن زده است که در سال 2020 نیمی از تقاضاي غذایی جهـان بـا آبزي پروري پاسخ داده خواهد شد. امروزه پـرورش میگـو درسرتاسر کشورهاي استوایی رایج شـده اسـت. در حـال حاضـر بیماري هاي زیادي پرورش میگوي سراسر جهان را تحت تاثیـر قرار داده اند. میکروارگانیسم هاي پاتوژن زیادي در ایـن شـیوع رایج هستند ( .(1 در میان مهم ترین معضل بهداشتی و بیمـاري هاي میگوي پرورشی، عوامل عفونی باکتریایی به ویـژه عوامـل مولــد ویــبریوزیس در میگوهــاي پنائیــده (Penaeidae) دیــده میشوند ( 2 و .(3 یکی از مهم ترین و جـدي تـرین بیمـاري هاي باکتریایی ویبریوزیس است که تلفات و خـسارات قابـل توجهی را در کارگاه هاي پرورش میگو ایجاد می نمایـد و از طرفی همین باکتري ها جزء میکروفلـوراي دسـتگاه گـوارش میگو نیز می باشند. بنابراین شناسایی فلور باکتریـایی میگـو از این نظر اهمیت دارد که می توان برخی باکتري هـاي فرصـت طلب ایجاد کننده بیماري هاي باکتریایی را شناسـایی و از آن ها به عنوان پروبیوتیک اسـتفاده نمـود .(4) بـراي حفاظـت و کنترل بیماري هاي میکروبی از آنتی بیوتیک ها، آفت کش هـا و سایر مواد شیمیایی استفاده می گردد کـه آنـتیبیوتیـک هـا باکتري ها را کشته یا رشـد آن هـا را بـه وسـیله مداخلـه در عملکردهاي اساسی آن ها از قبیل سنتز دیواره، RNA و DNA متوقف می کنند. ولی آنتی بیوتیک هـا سـبب بـروز مقاومـت باکتریایی نیز مـی گردنـد. نگرانـی در مـورد مقاومـت آنتـی بیوتیکی پژوهشگران را به جـستجوي راههـاي جدیـد کنـترل بیماري ها ترغیب نموده است. هم اکنون محققین با استفاده از باکتري هاي پروبیوتیک در آبزي پروري بـراي بهبـود کیفیـت آب تلاش می کننـد. ارگانیـسم هـاي پروبیوتیـک بـه عنـوان میکروب هاي زنده سبب تغییر جمعیت میکروبی محیط، بهبود کیفیت محیط اطراف میگوها، افزایش ارزش تغذیه اي میگو و افزایش پاسخ میزبان علیه میکروب ها می شوند .(1) مساله اي که وجود دارد این است که 60 تا 70 درصد هزینه تولید میگو مربوط به غذا است که با مصرف پروبیوتیک و افزایش ضریب هضم و جذب غذا ضریب تبدیل غـذا بهبـود یافتـه و هزینـه غذاي مصرفی به نصف کاهش می یابد. عـلاوه بـر ایـن %15
هزینه تولید میگو مربوط به تعویض آب است که بـا مـصرف پروبیوتیک کیفیت آب مزارع افزایش یافته و بـه دلیـل حـذف تعویض آب، هزینه تولید نیز کاهش می یابد. علاوه بـر مـوارد یاد شده می توان گفت که باکتري هاي دستگاه گوارش میگـو از محیط زندگی آن ها و آب تـاثیر مـی پذیرنـد و بـه طـور عجیبی وابسته به محیط خـارج آن هـستند. بنـابراین اسـتفاده ازپروبیوتیک هاي باکتریایی براي درمان محیط پرورشـی آبـزي بهتر از دیگر مکمل هاي غذایی مطرح می گردد 4) و .(5 یـک راه معمول براي انتخاب پروبیوتیک مناسب، شناسـایی بـاکتري هاي کاندید در شرایط آزمایـشگاه و بـه کمـک آزمـون هـاي آنتاگونیسمی است که در آن پـاتوژن هـا در معـرض تولیـدات خارج سلولی کاندیداهاي پروبیوتیک قرار می گیرند . (6) اسـتان بوشهر با اختصاص بیش از %56 از اراضی زیر کـشت میگـو و %64 تولید میگوي پرورشی کشور به خـود در سـال 1383 بـه عنوان پیشتاز صنعت میگوي کشور بوده، اما متاسـفانه در سـال هاي اخیر بروز بیماري ها و شرایط نامطلوب ضربه سـنگینی را به صنعت پرورش میگوي استان بوشهر وارد نمـوده اسـت .(7)
این پژوهش با هدف جداسازي و شناسـایی بـاکتري هـاي آب پرورشـــی و دســـتگاه گـــوارش میگـــوي ســـفید غربـــی (Litopenaeus vannamei) در اســتخرهاي پرورشــی اســتان بوشهر و بررسی آن ها به عنوان پروبیوتیک انجام شد.
مواد و روشها
الف) نمونه برداري و انتقال به آزمایشگاه: به منظور انجام نمونهبرداري 5 ایستگاه که شامل 10 استخر بودند در نظر گرفته شد. براي نمونه برداري میگو از استخرهاي پرورشی از تور دستی و سینی غذادهی و سالیک استفاده گردید. نمونه برداري هر 10 روز یک بار و همزمان با بیومتري میگوها انجام شد و هر روز عوامل دما، شوري، pH و .... بررسی و ثبت گردید. نمونه هاي جمع آوري شده بیمار و سالم به طور جداگانه به روش کاملاً استریل و خنک و در ورقه هاي آلومینیوم به آزمایشگاه منتقل شدند. براي نمونه برداري از آب پرورش میگو از لوله هاي درپیچ دار استریل استفاده گردید.
ب) تهیه کشت میکروبی و شناسایی: پس از ضدعفونی کردن سطح بدن میگوها و شستشو با آب مقطر، براي برداشتن قسمت هاي گوارشی، میگوها کالبد شکافی شدند. اندام هاي مشابه با آب مقطر استریل رقیق سازي گردیدند و روي پلیت هاي محیط کشت پخش شدند. از محیط کشت هاي پپتون واتر، تریپتیک سوي براث، نوترینت براث، تریتیک سوي آگار، نوترینت آگار، مک کانکی آگار، تیوسولفات سیترات بایل سالت سوکروز آگار (TCBS) و سودوموناس آگار (همگی مربوط به شرکت مرك کشور آلمان) به منظور جداسازي اولیه و تعیین شمارش کل باکتري ها (TPC) استفاده گردید. تمامی پلیت ها به مدت 24 تا 48 ساعت گرماگذاري شدند. رشد باکتري با کدر نمودن محیط مایع و ظهور پرگنه بر روي محیط کشت جامد مشخص گردید. سپس %10 نمونه هاي باکتریایی رشد یافته بر روي هر پلیت خالص سازي شدند.
براي نمونه هاي آب پرورش میگو نیز رقیق سازي انجام وسایر روش ها مطابق با روش هاي مشابه توصیفی براي نمونه میگو صورت گرفت 8) و .(9 پس از کشت اولیه، جداسازي و خالص سازي نمونه ها، به منظور بررسی وضعیت ریخت شناسی، آزمون هاي بیوشیمیایی مانند کاتالاز، اکسیداز، ایندول، گلوکز، آرابینوز و... انجام گردید (10) و تا حد امکان نسبت به شناسایی و طبقه بندي باکتري ها در سطح گونه اقدام شد. به منظور صحت شناسایی بیوشیمیایی، نمونه ها با نرم افزار بیولوگ در سطح گونه شناسایی گردیدند. میکروفلوراي جداسازي شده از دستگاه گوارش میگو که در TSB نگهداري شده بودند براي یافتن کاندیداي پروبیوتیک غربالگري شدند. در این آزمایش چند گونه باکتریایی به عنوان باکتري هاي بیماري زا مورد استفاده قرار گرفتند. دو روش آزمایش ضد باکتریایی شامل چاهک گذاري و دیسک گذاري براي تعیین پروبیوتیک مناسب انجام شد.
ج) بررسی فعالیت ضد باکتریایی نمونه ها به روش چاهک گذاري: در این روش یک کشت از باکتري هاي بیماري زا روي محیط جامد TSA تهیه گردید. پلیت ها در انکوباتور 30 درجه به مدت 15 دقیقه قرار داده شدند. سپس در پلیت ها چاهک هایی ایجاد شد. مقداري از نمونه هاي جداسازي شده در TSB را در چاهک ها پیپت کرده و پلیت ها براي 24 ساعت در انکوباتور پرورش داده شدند. قطر هاله عدم رشد اطراف چاهک ها به عنوان فعالیت ضدباکتریایی مشاهده و ثبت گردید 11) و .(12
د) بررسی فعالیت ضدباکتریایی نمونه ها به روش دیسک گذاري: براي این روش دیسک هایی تهیه شد. سپس دیسک ها در محتویات درون سلولی باکتري هاي جداسازي شده غوطه ور گردیدند و روي هر یک از عوامل باکتریایی بیماري زاي کشت شده روي پلیت TSA گذاشته شدند. سپس این پلیت ها به مدت 24 ساعت در دماي 30 درجه سانتی گراد گرما گذاري شدند و در نهایت قطر هاله عدم رشد اطراف دیسک ها اندازه گیري و ثبت گردید .(13)
یافتهها
الف) شمارش کلی باکتري ها: شمارش کلی باکتري هاي آب پرورشی و دستگاه گوارش میگوي سفید غربی روي محیط هاي TSA، TCBS، سودوموناس آگار و مک کانکی آگار در جدول 1 ذکر شده است.
ب) شناسایی فلور باکتریایی: پس از تعیین ویژگی هاي مورفولوژیک و بیوشیمیایی و بر اساس کتاب باکتري شناسی برگی، نمونه هاي جداسازي شده در 12 گروه مختلف طبقه بندي شدند. 12 جنس از آب استخرهاي پرورشی و دستگاه گوارش میگو شناسایی گردیدند. جنس هاي غالب جداسازي شده شامل ویبریو ، باسیلوس و سودوموناس بودند. بیشتر
باکتري هاي جداسازي شده از نمونهها گرم منفی بوده اما نمونه هاي گرم مثبت نیز شامل باسیلوس ، میکروکوکوس و استافیلوکوکوس نیز جداسازي گردیدند. تنوع و فراوانی باکتري هاي جداسازي شده در جدول 2 نشان داده شده است.
نتایج بررسی فعالیت ضدباکتریایی نمونه هاي جداسازي شده در برابر عوامل باکتریایی بیماري زا به روش هاي چاهک گذاري و دیسک گذاري در جدول 3 نشان داده شده است. باسیلوس ، میکروکوکوس و کورینه باکتریوم فعالیت ضدباکتریایی بیشتري را در مقابل شش باکتري بیماري زا (آئروموناس هیدروفیلا ، ویبریو پاراهمولیتیکوس ، اشریشیا کلی ، سودوموناس ، سالمونلا و ویبریو کلرا) نشان دادند.
باسیلوس ها هاله عدم رشد بیشتري را در مقابل باکتريهاي بیماري زا در هر دو روش نشان دادند. در روش چاهک گذاري قطر هاله عدم رشد 15 mm بود، اما در روش دیسک گذاري قطر هاله عدم رشد 9 mm بود.
