بخشی از مقاله
چکیده
مقدمه: پروبیوتیک ها بعنوان مکمل هاي غذایی زنده شناخته شده اند و در سلامت میزبان از طریق بهبود تعادل رودهاي، اثرات مفیدي دارند. لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوسATCC 4356 1 بعنوان پروبیوتیک کاربرد فراوانی دارد.
هدف: هدف از انجام این تحقیق، جداسازي لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس در مدفوع انسان به روش RT-PCR می باشد.
روش: در این تحقیق ژن پروتئین لایه سطحی - slpA - A لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ATCC 4356 بعنوان یک مدل انتخاب شد چرا که mRNA این ژن در سطح بالا و نسبتا پایداري رونویسی می شود. لاکتوباسیلوس از مدفوع انسان جدا شده و کل RNA آنها استخراج گردید. بیان ژن slpA به وسیله RT- PCR بررسی شد.
نتیجه: بیان ژن slpA در 14 نمونه شناسایی شد و در 36 نمونه بیان ژن slpA مشاهده نگردید. برطبق نتایج حاصله از این مطالعه، ما دریافتیم که در دستگاه گوارش تمام افراد مورد آزمون، لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس وجود ندارد و احتمالا گونههاي دیگر لاکتوباسیلوس در آن ها وجود داشته باشد.
کلمات کلیدي: لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، پروتئین لایه سطحی، .S-layer
مقدمه
دستگاه گوارش انسان یکی از محلهایی است که بیشتر از همه در معرض میکروارگانیسمهاي پاتوژن و مواد غیرزنده از جمله آنتیژنها و مواد سرطانزا میباشد. فلور میکروبی دستگاه گوارش نقش بسیار مهمی در توسعه آناتومیکی، فیزیولوژیکی و ایمونولوژیکی میزبان بازي می کند. میکروفلور روده باعث تحریک سیستم ایمنی در پاسخ به عفونت به وسیله پاتوژنها شده و همچنین از طریق آنتاگونیسم باکتریایی مانع از کلونیزاسیون آنها در روده میشوند - . - 16 ,12 ,7 ,1 امروزه پروبیوتیکها بعلت اینکه براي سلامت میزبان مفید شناخته شدهاند و باعث بهبود تعادل میکروبی دستگاه گوارش میزبان میشوند بسیار اهمیت پیدا کردهاند. دو جنس لاکتوباسیلوس و بیفیدوباکتریوم، متداولترین باکتریهایی هستند که بعنوان پروبیوتیک در انسان استفاده میشوند - . - 16 ,14
لاکتوباسیلوسها بعنوان فلور طبیعی دستگاه گوارش و دستگاه ادراري تناسلی انسان و حیوانات و همچنین در انواع مختلف لبنیات نیز شناخته شده اند . - 14 ,12 ,11 ,8 ,1 - لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوسATCC 4356،یکی ازسویه هاي جنس لاکتوباسیلوس میباشد که بعنوان پروبیوتیک کاربرد فراوانی دارد. یکی از خصوصیات مهم آن وجودساختار2S-layer در این باکتري است که توسط آن قادر به اتصال به سلولهاي اپی تلیال میزبان می باشد - ,11 ,10 ,8 ,3. - 18 به طور کلی عملکرد عمومی براي این ساختار در باکتریها شناخته نشده است ولی تصور می شود که در برخی از باکتریها این ساختار باعث حفاظت باکتري از عوامل محیطی مضر می شود، همچنین مشخص گردیده که در لاکتوباسیوس ها این ساختار باعث اتصال باکتري به سلول میزبان می شود . - 15 ,11 ,10 ,8 ,1 - امروزه پیشرفت هاي زیادي در جهت تشخیص مولکولی میکروفلور دستگاه گوارش انسان صورت گرفته است.
تشخیص میکروفلور دستگاه گوارش در شناسایی فرآیند غذایی، عملکرد سیستم ایمنی و فعالیت هاي دیگر میزبان بسیار مهم است. بررسی هاي میکروبیولوژي در نمونه هاي مختلف نشان داده که PCR بعنوان یک روش آنالیز مولکولی براي شناسایی گونه هاي مختلف جنس لاکتوباسیلوس، کارآمد می باشد - . - 19, 13 ,9 ,7 ,6 ,5 ,1با توجه به کاربرد بسیار زیاد لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بعنوان پروبیوتیک و استقرار جنس هاي مختلف لاکتوباسیلوس به صورت فلور میکروبی در دستگاه گوارش - 19 ,16 ,11 ,8 ,3 ,1 - و اهمیت ساختار S-layer در اتصال باکتري به سلول هاي اپیتلیال روده و حفاظت آن در شرایط نامساعد محیطی - 18 ,11 ,10 ,8 ,1 - ، برآن شدیم تا لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس را براساس تشخیص اختصاصی ژن slp A لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ATCC 4356 در نمونههاي مدفوع با روش RT-PCR ، شناسایی نماییم.
مواد و روش ها
سویه باکتریایی و کشت آن: سویه لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوسATCC 4356 از کلکسیون میکروبی آلمان تهیه شده و در محیط MRS broth - Merck - در شرایط بی هوازي در دماي 37ºC به مدت 48 ساعت کشت داده شد. از لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ATCC4356 بعنوان شاهد مثبت استفاده شد.جمع آوري نمونه مدفوع و آماده سازي آنها: نمونه هاي مدفوع تازه از 50 زن جوان در محدوده سنی 25-30 سال جمع آوري شدند و بر روي یخ به آزمایشگاه منتقل شده و به نسبت 1:10 در بافرفسفات رقیق گردیدند. آماده سازي نمونه ها جهت استخراج RNA، مطابق منبع - 20 - با کمی تغییرات انجام شد. سوسپانسیون تهیه شده با سرعت 200 ×g به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ گردید و محلول رویی نگهداري شد این عمل سه مرتبه تکرار شده و در نهایت براي جمع آوري باکتریها، محلول رویی را به مدت3 دقیقه با دور 9000 ×g سانتریفوژ گردید.
رسوب حاصل پس از شستشو در آب مقطر - 1ml - بصورت سوسپانسیون درآمده و جهت استخراج RNA استفاده شد.استخراج کل RNA و سنتز :cDNA استخراج کل RNA از رسوب باکتریهاي جداسازي شده از مدفوع توسط کیت استخراج - Protective Rneasy Minikit- Qiagen - RNA مطابق با دستورالعمل شرکت سازنده، صورت گرفت. پس از استخراج کلRNA، RNAهاي استخراج شده تحت تیمار آنزیم - DNase I, RNase- free; Fermentaz - DNase I در دماي 37ºC به مدت 30 دقیقه مطابق با دستورالعمل شرکت سازنده، قرار گرفتند. سپس با استفاده از کیت سنتز First Strand - cDNA - cDNA synthesis Kit; Fermentaz مطابق با دستورالعمل آن، سنتز cDNA از روي کل RNA انجام شد 150ng - از RNA کل به همراه 0/5 میکروگرم از پرایمر Oligo dT استفاده گردید - .
تکثیر به روش :RT- PCR پرایمرهاي بالادست - 5'-TGG CCG TTC TTG AAT GTG TA-3' - 3 و پائین دست4 - 5'-ACA TCA ACG CTG CAA ACA TC-3' - اختصاصی ژن slp A براي واکنش PCR استفاده شدند. طول قطعه تکثیر شده توسط این پرایمرهاي اختصاصی 154bp می باشد. علاوه بر پرایمر فوق ، از پرایمرهاي RW01، dg 74 براساس منبع - 17 - براي اتصال و رونویسی بخشی از ژن 16S rRNA که بعنوان ژن کنترل داخلی5 در این تحقیق بکار رفت، استفاده گردید. 1 میکرولیتر از - 7/5 ng - cDNA به PCR Master Mix با حجم نهایی 25 میکرولیتر - هرویال محتوي 0/5 میکرولیتر dNTPs ، 0/5 میکرولیتر Mgde2، 0/25 میکرولیتر - - 5U/l آنزیم Taq polymerase و 100 پیکومول از هر پرایمر - اضافه گردید. برنامه PCR شامل ، دناتوراسیون اولیه در 94ºC براي 5 دقیقه و به دنبال آن سیکل اصلی با 30 تکرار شامل دناتوراسیون در 94ºC به مدت 45 ثانیه، اتصال پرایمر در 54ºC به مدت 30 ثانیه و تکثیر به مدت 30 ثانیه در دماي 72ºC انجام شد. محصول واکنش در ژل آگارز %1 الکتروفورز گردیده و پس از رنگ آمیزي با اتیدیوم برماید نتایج با UV مشاهده شدند.
نتایج و بحث
پس از استخراج RNA از نمونه هاي مدفوع انسان و تیمار آن با DNase I، از cDNA سنتز شده براي تایید تکثیر ژن 16S rRNA بعنوان ژن کنترل داخلی بکار برده شد. در نتایج RT-PCR حاصله، یک باند واضح 370bp در تمامی RNAها مشاهده گردید و صحت سنتز cDNA تائید شد.نتایج حاصل از بررسی بیان ژن slpA توسط RT-PCR در 50 نمونه RNA استخراج شده از مدفوع انسان نشان داد که ژن slpA تنها در 14 نمونه بیان شده است - %28 - - شکل - 1 و در 36 نمونه این ژن بیان نگردید. براساس نتایج بدست آمده به نظر می رسد که در 36 نمونه فاقد ژن slpA، لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ATCC 4356 و سویه هاي وابسته به آن مانند لاکتوباسیلوس اسیدفیلوس NCFM، وجود نداشته است و احتمال می رود که گونه هاي دیگر لاکتوباسیلوس در دستگاه گوارشی آنها مستقر باشد. شایان ذکر است که نیمه عمر mRNA ژن slpA در حدود 15 دقیقه می باشد - 7 ,4 - و همچنین ترکیب اسیدهاي آمینه در پروتئین S-layer گونه هاي مختلف لاکتوباسیلوس مشابه می باشند ولی تشابه توالی ژنهاي S-layer فقط در بین سویه هاي وابسته بهم دیده شده است . - 1 -
ژنهاي کدکننده پروتئین S-layer از دو سویه لاکتوباسیلوس برویس، یک سویه لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، یک سویه لاکتوباسیلوس هلوتیکوس و یک سویه لاکتوباسیلوس کریسپاتوس کلون و تعیین توالی شده اند و مشخص گردیده است که درهرگونه توالی ژن کدکننده پروتئین S-layer اختصاصی آن گونه می باشد . - 14 ,4 ,1 - همچنین در مطالعات انجام شده، دریافتند که بیش از یک ژن کد کننده پروتئین S-layer در هر سویه وجود دارد . - 18 ,7 ,2 ,1 - در مطالعات متعدد مشخص گردیده که در فلور دستگاه گوارش تمام انسان ها و حیوانات جنس هاي مختلف لاکتوباسیلوس وجود دارد . - 19 ,13 ,12 - بنابراین عدم بیان ژن slpA نشان دهنده عدم حضور گونه هاي مختلف لاکتوباسیلوس در دستگاه گوارش نمی باشد لذا با توجه به اهمیت نقش پروبیوتیکها در سلامت میزبان، لازم است که در مطالعات آینده گونه هاي مختلف لاکتوباسیلوس در دستگاه گوارش مورد بررسی و تحقیق قرار گیرند.
