بخشی از مقاله
چکیده:
امروزه حفظ تنوع گونههای گیاهی و جلوگیری از فرسایش تنوع ژنتیکی از اهمیت دوچندانی برخوردار است. در این میان گیاه بادرنجبویه دنایی - . - Dracocephalum kotschyi Boiss بر اثر برداشتهای بی رویه و تغییرهای آب و هوایی در معرض خطر انقراض قرار گرفته است؛ بطوریکه حفظ ذخایر ژنتیکی این گونه مهم دارویی از اهمیت باالیی برخوردار میباشد. هدف از این مطالعه بررسی اثر محلول های مختلف PVS2 و PVS3 در روش شیشه ای شدن بر روی شاخص های رشدی بذر های بادرنجبویه دنایی همچون درصد جوانه زنی، بقای بذر، طول جوانه، طول ریشه و ساقه چه بود. نتایج نشان داد که طول ریشه چه و ساقه چه در محلول های شیشه ای شدن تفاوت معنی داری نسبت به شاهد نداشتند. درصد و سرعت جوانه زنی، طول جوانه ها و شاخص بنیه بذر در محلول PVS2 نسبت به شاهد کاهش معنی دار نشان داد. اما تفاوت معنی داری بین محلول PVS3 و شاهد دیده نشد و می توان نتیجه گرفت که نگهداری ژرم پالسم بذر های بادرنجبویه در روش شیشه ای شدن با استفاده از محلول PVS3 موثر تر از محلول PVS2 می باشد.
کلمات کلیدی: بادرنجبویه دنایی، شاخص های جوانه زنی، شیشه ای شدن، فنآوری حفاظت فراسرد
.1 مقدمه:
گیاه بادرنجبویه از مهم ترین جنس های تیره نعناعیان بوده که شامل 151 گونه می باشد که 5 گونه ی آن در ایران میروید. یکی از گونه های مهم و بومی این گیاه در ایران kotschyi Dracocephalum است که در قسمت هایی از شمال، غرب و مرکز ایران یافت می شود - . - 11 این گونه انحصاری، با نام زرین گیاه و بادرنجبویه دنایی شناخته می شود. بعلت برداشت بی رویه این گیاه بویژه در مرحله گلدهی توسط افراد بومی که مانع از به بذر نشستن این گیاه شده و در نتیجه باعث کاهش جمعیتاین گیاه در محل شده است. بنابراین بادرنجبویه دنایی یکی از گیاهان در معرض انقراض ایران می باشد - . - 12 تحقیقات نشان داده که این گیاه از لحاظ دارویی ارزشمند بوده - 9 - و از جمله ترکیبات مهم آن میتوان به اسانس - 23 - فالونوئید و رزماریک اسید - 2 - و گلیکوزیدهای مونوترپن - 15 - اشاره نمود.
ژرم پالسم گیاهی از مهم ترین منابع و ثروت های هر کشور محسوب می شود که بایستی در حفظ و نگهداری آن اقدامهای الزم انجام گیرد. بررسیها نشان میدهد که نگهداری و حفظ بذر گونه های گیاهی ارزشمند و در حال انقراض در سردخانه برای مدت زمان طوالنی میسر نیست. در این میان روش حفاظت فراسرد، به معنای ذخیره سازی نمونه های زیستی - یاخته، بافت یا اندام ها - در ازت مایع با دمای-191 c˚ است که از اصلی ترین و موفق ترین روش های نگهداری درازمدت ژرم پالسم گیاهان ارزشمند و در حال انقراض به شمار میرود . - 4 - در این دما تقسیم یاختهایی و فعالیتهای متابولیسمی به حالت تعلیق در میآیند و ماده گیاهی بدون هیچ تغییری ذخیره می شو د و در زمان خاص و در صورت لزوم فرآیندهای بازیابی صورت می گیرد . - 23 -
حفاظت فراسرد، یک فناوری توسعه یافته ای برای بقای مواد ژنتیکی و از معدود روشهای موجود برای حفاظت دراز مدت ژرمپالسم گیاهان است. از این رو خطرفرسایش ژنی و از دست رفتن ذخایر ژنتیکیکاهش می یابد. در این زمینه، یکی از روشهای مؤثر واستاندارد در افزایش کارایی نگهداری و زنده مانی نمونه های گیاهی در شرایط انجماد، روش شیشه ای شدن با استفاده از محلول های شیشه ای شدن PVS213 و PVS311 است. درحقیقت، شیشه ای شدن فرایندی است که آب از حالت مایع وارد یک فاز شیشه ای بی شکل می شود که فاقد ساختار کریستالی است. در این حالت نگهداری بافت های گیاهی در ازت مایع بدون تشکیل کریستال های یخ امکان پذیر خواهد بود - . - 5
به منظور انجام فرایند شیشه ای شدن ،کاهش میزان آب یاخته به %33-23 ضروریست - . - 22 اولین گزارشها در زمینه استفاده از انجماد شیشه ای شدن در سال 1959 داده شد. 18 سال بعد از اولین گزارش، این روش به عنوان گسترده ترین پروتکل انجماد استفاده گردید. موفقیت این روش سهولت آن است. همچنین این روش به خوبی برای محدوده وسیعی از گونه ها و بافت های گیاهی مورد استفاده قرار گرفته است - . - 18 شیشه ای شدن شامل استفاده از محلول های تعادلی با ویسکوزیته و قابلیت آبگیری باال است - . - 13در این پژوهش پاسخ شاخصهای جوانه زنی و رشد بذر بادرنجبویه دنایی به دمای فراسرد مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور تکنیک نگهداری به روش انجماد شیشه ای به عنوان یک نسخه پشتیبان و نیز یک روش جایگزین و مقرون به صرفه برای ذخیره کردن بلند مدت بذرهای بادرنجبویه دنایی مورد ارزیابی و آزمایش قرار گرفت.
.2مواد و روشها:
.1.2 مواد:
بذر بادرنجبویه دنایی - - Dracocephalum kotschyi از خانواده نعناعیان از پاکان بذر اصفهان تهیه گردید. ابتدا در آزمایشگاه بذرها از مواد خارجی، بذرهای نرسیده، پوک و شکسته جدا شد. بذرها با هیپوکلریت سدیم یک در صد به مدت 8 دقیقه ضدعفونی و پس از چند بار شستشو با آب مقطر استریل، برای آبگیری آماده شدند.
.2.2 انجماد شیشهای pvs2 و : pvs3
بذرهای ضد عفونی شده را به مدت 23 دقیقه در محلول تعادلی سترون، حاوی گلیسرول 2 موالر و سوکروز 3.1 موالر قرار داده و یک ساعت شیکر کردیم 93 - دور در دقیقه - ؛ سپس محلول تعادلی تخلیه شده و محلول آبگیری pvs2 که حاوی - W/V - 18% اتیلن گلیکول ، - W/V - %18 دی متیل سولفوکساید، - W/V - %33 گلیسرول و 3.4 موالر ساکاروز - 19 - و محلول آبگیری pvs3 که حاوی - W/V - % 83 سوکروز و - W/V - %83 گلیسرول است - - 14 به مدت 23 دقیقه در دمای4 c˚ جایگزین شد. سپس بذرها را به فالکون منتقل کرده و مستقیما به مدت 23 ساعت وارد کپسول نیتروژن مایع کردیم. بذرها پس ازاینکه از کپسول نیتروژن مایع خارج شد بالفاصله به مدت 3 دقیقه در بن ماری 43 c˚ قرار داده شدند تا عمل ذوب صورت گیرد. به منظور حذف مواد محافظ سرما، بذرها به مدت 23 دقیقه وارد محلول تخلیه که حاوی 1.2موالر ساکارز است شدند. گروهی از بذرهای ضد عفونی شده به عنوان شاهد و گروهی دیگر از بذرهای ذوب شده از روش شیشهای شدن را برای جوانه زنی به پتری دیشهای استریل که کف آنها یک الیه کاغذ صافی استریل قرار دارد منتقل کرده و نمونه ها را در ژرمیناتور با دمای+23 c˚ قرار دادیم.
.2 اندازه گیریها:
هر تیمار دارای سه تکرار و هر تکرار حاوی 33 ریز نمونه بود. جوانه زنی بذور 13 روز به طول انجامید در این مدت تیمارها هر روز در ساعت معینی بررسی و تعداد بذرهای جوانه زده ثبت گردید و پارامترهایی همچون درصد جوانه زنی، سرعت جوانه زنی، میانگین طول ریشهچه، ساقه چه و شاخص بنیه بذر محاسبه شد.درصد جوانه زنی بذرهای بادرنجبویه دنایی از رابطه زیر محاسبه شد - . - 13
در این رابطه Ni تعداد بذرهای جوانه زده در روز nام و N تعداد کل بذرها است - . - 3 یادداشت برداریها صورت گرفت و سرعت جوانه زنی بر اساس روش ماگوبرو طبق فرمول زیر محاسبه شد - . - 11بعد از رشد کافی گیاهچه ها، در روز 13، طول ساقه چه و ریشه چه بیست گیاه از هر پتری دیش اندازه گیری شد و با در دست داشتن درصد جوانه زنی و میانگین طول کلی گیاهچهها، شاخص بنیه بذر با فرمول زیر محاسبه گردید - . - 1میانگین طول گیاهچه × درصد جوانه زنی= شاخص بنیه بذر
