بخشی از مقاله
مقدمه
استفاده از سیگار موجب می شود تعداد زیادي مواد شیمیایی سمی از طریق حفره دهانی به سیستم بیولوژیکی بدن وارد شوند. این ترکیبات خطرناك ممکن است در دهان ایجاد مشکلات لثه، پوسیدگی دندان و بیماریهاي دیگر بافت دهانی شوند .(27) به علاوه، برخی بیماریهاي مهم انسان از قبیل مشکلات قلبی عروقی و تنفسی نیز ممکن است به دلیل سیگار کشیدن ایجاد و یا تشدید شوند.
تحقیقات نشان داده اند که دود سیگار حاوي بیش از 4000
نوع مواد شیمیایی است که حداقل یک دهم آنها در دسته کارسینوژن ها طبقه بندي شده اند .(34) بر اساس تحقیقات Peterson و همکاران (2010) دود سیگار همچنین حاوي ترکیبات اکسیدانت قوي مانند رادیکالهاي اکسیژن، ازت و آلدئیدهاي فرار است .(24) ترکیبات اکسید کننده می توانند آسیبهاي جدي به مولکولهاي حیاتی
125
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
مانند پروتئینها و آنزیمها وارد کرده و مشکلات فیزیولوژیکی مختلف را سبب شوند. گونه هاي فعال اکسیژن (ROS) و نیتروژن (RNS) در اثر متابولیسم طبیعی سلولی به وجود می آیند. گونه هاي ROS و RNS
می توانند مفید و یا مضر باشند و به این ترتیب نقش دو جانبه اي در سیستمهاي زنده ایفاء می کنند . اثرات مفید
ROS در غلظتهاي پائین نامتوسط رخ می دهد به عنوان مثال دفاع در برابر عوامل عفونی و همچنین عملکرد تعدادي از تقسیمهاي سیگنالینگ سلولی به عنوان عملکرد فیزیولوژیکی ROS شناخته شدهاند. مثال دیگري از اثرهاي مفید ROS در غلظت پایین تا متوسط، القاي واکنش متوژنیک است. این در حالی است که تولید بالاي ROS /RNA در سیستمهاي بیولوژیکی و همچنین نقص و کمبود در آنتی اکسیدانتهاي آنزیمی و غیر آنزیمی اثرات مضر رادیکال آزاد و خطرات بیولوژیکی همانند استرس اکسیداتیو و نیتروزاتیو را ایجاد می کند 38) و .(39 بسیاري واکنشهاي آنزیمی می تواند منبع تولید رادیکال آزاد باشند، به عنوان مثال می توان از واکنشهاي زنجیرة تنفسی، فاگوسیتوز و سنتز پروستا گلاندین نام برد. آنتی اکسیدانتها با جمع آوري رادیکال و یا جلوگیري از تشکیل آنها، از سلولهاي بدن محافظت می کنند . ترکیبات آنتی اکسیدانت الکترون اضافی دارند که می توانند در اختیار رادیکال آزاد قرار دهند با این کار رادیکال آزاد دیگر براي جفت کردن الکترونها به قسمتهاي حیاتی حمله نمی کند . (38 )
ترکیبات آنتی اکسیدانت نقش مهمی در حفظ سلامتی ایفاء می کنند. آنتی اکسیدانتهایی از قبیل آسکوربیک اسید، فنولیک اسید، پلی فنلها و فلاونوئیدها از طریق جمع آوري رادیکالهاي پر اکسید و هیدروپراکسید می توانند از آسیب اکسیداتیو که منجر به بیماریهاي پر خطر می شود ، جلوگیري کنند . نتایج برخی تحقیقات پیشنهاد می کند که آنتی اکسیدانتها از خطر بیماریهاي قلبی و سرطان می کاهند
33) و .(42 بزاق اولین مایع بیولوژیکی است که با مواد خارجی مثل غذا، نوشیدنیها یا ترکیبات فرار موجود در
محیط مواجهه شده و واکنش می دهد و در نتیجه نقش مهم در سلامت حفره دهانی دارد .(6) از آنجا که جمع آوري بزاق از طریق روشهاي غیر تهاجمی انجام شده و نیاز به تخصص ویژه اي ندارد، بنابراین می تواند به عنوان یک مایع بیولوژیکی ارزشمند براي بررسی برخی تغییرات بیوشیمیایی مورد توجه قرار گیرد. بزاق داراي مکانیسمهاي دفاعی مختلف است که باعث حمله به باکتري، ویروس و قارچها شده و در برابر حمله مکانیکی و یا شیمیایی نیز نقش محافظتی دارد. Nagler و همکاران (2002) ثابت کردند بزاق توانایی آنتی اکسیدانتی داشته و می تواند گونه هاي رادیکال اکسیژن مثل سوپر اکسید (O2-) را غیرفعال کند. رادیکالهاي آزاد قوي ممکن است باعث تغییرات مختلف روي موکوس دهانی و ایجاد عفونتهاي متعدد و حتی سرطان شوند .(22) خاصیت ضد سرطان بزاق به طور ویژه در پیشگیري از پیشرفت سرطان دهان در تحقیقات زیادي مورد بررسی قرار گرفته است 4) و . (21
سیستم آنتی اکسیدانتی بزاق شامل مولکولهاي غیر آنزیمی
و آنزیمهاست آنتی اکسیدانتهاي بزاقی شامل سه گروه می باشند: آنتی اکسیدانتهاي خارج سلولی مثل اوریک اسید، آنتی اکسیدانتهاي سلولی مثل آسکوربیک اسید و آنتی اکسیدانتهاي آنزیمی مثل سوپر اکسید دیسموتاز، پراکسیداز
و کاتالاز. از مهم ترین آنتی اکسیدانتهاي بزاقی می توان اسید اوریک و آنزیم پراکسیداز را نام برد که هر دو محلول در آب هستند. آنتی اکسیدانتهاي محلول در لیپید توسط لیپو پروتئینها حمل می شوند که غلظتشان در بزاق خیلی کم است در واقع کمتر از 10 درصد ظرفیت آنتی اکسیدانتی بزاق را ایجاد می کنند 14) و .(22 در این تحقیق فعالیت سه آنزیمهاي آنتی اکسیدانت، پراکسیداز، سوپراکسید دیسموتاز و کاتالاز، در بزاق افراد سیگاري با دسته اي شاهد مقایسه شد. آنزیمهاي پراکسیداز بزاقی دو نوع می باشند، ولی از آنجایی که از نظر خواص آنتی اکسیدانتی تفاوتی بین فعالیت دو فرم پراکسیداز نیست، در
126
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
این تحقیق فعالیت کل پراکسیداز بزاقی بدون توجه به نوع آنها بررسی گردید.
مواد و روشها
نمونه برداري: داوطلبها شامل دو دسته 25 نفري مرد -20 25 سال بودند.گروه مورد آزمایش افرادي بودند که همه آنها از حدود 5-3 سال قبل سیگاري شده بودند و روزانه
12-10 عدد سیگار از نوع مشابه استفاده می کردند. گروه شاهد از میان افراد سالم با سن و شرایط مشابه ولی غیر سیگاري انتخاب شدند. نمونه هاي بزاق غیر تحریکی که طی 3 دقیقه ترشح شده بودند به حجم حدود 20-10 میلی لیتر در لوله هاي موئین استریل جمع آوري، علامت گذاري و تا هنگام آزمایش در -70 درجه نگهداري شدند.
براي هر سنجش آنزیمی، سپس نمونههاي بزاقی به مدت
30 دقیقه با سرعت 6000 دور/دقیقه سانتریفیوژ شدند و از مایع رویی زلال براي آزمایش مربوطه استفاده شد.
محاسبه سرعت جریان بزاق غیر تحریکی: سرعت جریان
(Flow Rate) با تقسیم حجم بزاق غیر تحریکی جمع آوري شده (میلی لیتر) به زمان لازم براي جمع شدن آن حجم (دقیقه) به دست آمد.
اندازه گیري (pH) نمونه هاي بزاق: مقدار pH نمونه هاي بزاقی، بعد از عمل سانتریفیوز و رقیق نمودن آنها توسط آب مقطر (به میزان 50 درصد)، با استفاده از دستگاه pH
متر، که توسط بافرهایی با pH مشخص کنترل شده بود، اندازه گیري گردید.
تعیین فعالیت سوپراکسید دیسموتاز :(SOD) فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز، با استفاده از روش اسپکتروفتومتري اندازهگیري شد .(37) در عمل، مخلوط مورد آزمایش متشکل از 0/5 میلی لیتر محلول واکنش
0/1 EDTA) میلیمولار، بافرفسفات 50 میلیمولار، نیتروبلوتترازولوم 75 (NBT) میکرومولار و ریبوفلاوین
0/21 میلیمولار) با یک میلی لیتر بزاق مخلوط گردید.
کووتهاي حاوي محلول واکنش به مدت 30 دقیقه در حالی که به آرامی به هم زده میشدند، در معرض پرتو فلورسانس 2) عدد لامپ 20 وات فلورسانس) قرار گرفتند و سپس جذب نمونهها و کنترلها در طول موج 560
نانومتر در مقابل بلانک قرائت شد. در نهایت، با استفاده از فرمول زیر مقدار فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز بزاقی تعیین گردید .(35)
جذب بلانک- جذب نمونه مورد آزمایش
------------------------------ × 100
جذب بلانک
هر واحد فعالیت SOD عبارت است از مقداري از آنزیم که براي 50 درصد مهار احیاي فتوشیمیایی NBT تحت شرایط سنجش لازم باشد .(1)
سنجش فعالیت پراکسیداز(:(POD براي اندازهگیري فعالیت آنزیم پراکسیداز از سوبستراي -4آمینوآنتی پیرین در حضور پراکسید هیدروژن استفاده شد و فعالیت آنزیم در دماي اطاق در بافر مشخص اندازهگیري گردید. نمونه حاوي 480 میکرولیتر -4آمینو آنتی پیرین 480 +
میکرولیتر پراکسید هیدروژن 40 + میکرولیتر بزاق بود. لوله بلانک (شاهد) نیز حاوي 480 میکرولیتر -4آمینو آنتی پیرین 480 + میکرولیتر پراکسید هیدروژن 40 + میکرولیتر بافر فسفات با pH مساوي 7/0 بود. نمونههاي استاندارد بعد از رسیدن به دماي مورد نظر به سوبسترا اضافه شدند و پیشرفت واکنش آنزیمی با استفاده از اسپکتوفتومتر در طول موج 510 نانومتر مورد بررسی قرار گرفت و تغییرات جذب بر زمان ثبت شد. در نهایت، دادههاي به دست آمده را بر عدد 6/58 تقسیم کرده فعالیت پراکسیداز محاسبه گردید . (10)
فعالیت آنزیم کاتالاز(: (CAT براي اندازهگیري فعالیت
کاتالاز، بافرفسفات 50 میلی مولار (pH = 7) با 10 میلی-
مولار پراکسید هیدروژن ترکیب شده و سپس دو کووت از جنس کوارتز انتخاب شدند. در کووت بلانک 500 میکرو-
لیتر از ترکیب بافرفسفات و پراکسید هیدروژن و در کووت
127
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
دیگر 460 میکرولیتر از ترکیب بافرفسفات و پراکسید هیدروژن و 40 میکرولیتر از بزاق اضافه شده و با استفاده از دستگاه اسپکتوفتومتر به صورت کاینتیک در طول موج
240 نانومتر به مدت 2 دقیقه و به فاصلههاي 10 ثانیهاي ثبت گردید و در نهایت اعداد به دست آمده بر عدد 39/4
تقسیم شد و فعالیت آنزیم کاتالاز محاسبه گردید . (40 )
مطالعات آماري: همه آزمایشهاي سنجش آنزیمی با حداقل
3 تکرار انجام شد و سپس آنالیزهاي آماري مربوطه با استفاده از آزمون دانکن در SPSS صورت گرفت و نمودارهاي تغییرات مربوطه در برنامه Excel رسم شد.
جدول -1 تغییرات سرعت جریان بزاق در اثر استفاده از سیگار. اعداد داده شده میانگین حجم جمع آوري شده از هر داوطلب میانگین ± انحراف استاندارد (SD) می باشند.
فاکتور بزاقی سیگاري (متوسط (SD ± غیرسیگاري (متوسط(SD ± مقدار P*
سرعت جریان (ml/min) 1/18 ± 0/31 5/05 ± 0/9 ≤ 0/001
مقدار pH 5/9 ± 0/23 7 ± 0/12 ≤ 0/001
سوپراکسید دیسموتاز (U/ml) 0/317 ± 0/03 0/582 ± 0/08 ≤ 0/001
فعالیت پراکسیداز (mU/ml) 0/014 ± 0/009 0/028 ± 0/008 ≤ 0/001
فعالیت کاتالاز (U/ml) 0/016 ± 0/007 0/047 ± 0/013 ≤ 0/001
شکل -1 مقایسه فعالیت سوپراکسید دیسموتاز در بزاق افراد سیگاري در مقایسه با داوطلبهاي سالم. اعداد استفاده شده میانگین آزمایشهاي مربوط به مجموع آزمودنیها هستند.
نتایج
این پژوهش با هدف بررسی اثر دود سیگار بر تغییرات آنتی اکسیدانتهاي بزاقی مردان انجام گردید. از آنجایی که حجم بزاق و pH آن می توانند از عوامل مهم اثر گذار روي فعالیت آنتی اکسیدانتی بزاق داشته باشد، تغییرات آنها
نیز مورد بررسی قرار گرفتند. سرعت جریان بزاق با اندازه گیري حجم جمع آوري شده در زمان معین و سپس تبدیل به میلی لیتر/دقیقه تعیین شد. نتایج نشان دادند که کاهش حجم بزاق در افراد سیگاري نسبت به گروه شاهد غیر سیگاري، تفاوت معنی داري دارند (جدول .(1 تغییرات
pH در افراد سیگاري به طور متوسط 30 درصد کاهش
128
مجله پژوهشهاي سلولی و مولکولی (مجله زیست شناسی ایران) جلد 27، شماره 1، 1393
نشان می دهند. با توجه به داده هاي این جدول که همه اکسیدانتی مورد مطالعه نیز کاهش یافتند.
اعداد میانگین همه داوطلبهاست، فعالیت هر سه آنزیم آنتی
شکل -2 مقایسه فعالیت پراکسیداز در بزاق افراد سیگاري در مقایسه با داوطلب هاي سالم. اعداد استفاده شده میانگین آزمایش هاي مربوط به مجموع آزمودنی ها هستند.
شکل -3 مقایسه فعالیت کاتالاز در بزاق افراد سیگاري در مقایسه با داوطلب هاي سالم. اعداد استفاده شده میانگین آزمایش هاي مربوط به مجموع آزمودنی ها هستند.
