بخشی از مقاله
مقدمه
در دهههای اخیر نانوذرات به علت پتانسیل
کاربردشان در علوم مختلف مثل علوم زیستی و پزشکی
توجه رو به رشدی را به خود جلب کردهاند، ولی
مخاطراتی نیز دارند، به عنوان نمونه مشخص شده است نانوذرات خروجی اگزوز وسایل نقلیه دیزلی دارای اثرات
زیانآوری از قبیل آثار سیستمیک و قلبی - عروقی بر
سلامت انسان هستند.اخیراً به منظور پیشبرد ایمن
نانوتکنولوژی، آگاهی از اینکه باید بر هم کنش بین سلولها و نانومواد پا به پای توسعه کاربرد نانومواد روشن شود، رو به رشد میباشد. این موضوع در سالهای اخیر
به طور فزایندهای از سوی گروه بسیاری از محققان در
تعداد زیادی از مقالات مورد توجه و تاکید قرار گرفته است .(1)
نانوذرات ساختارهایی هستند که خواص آنها از اندازه کوچک، ترکیب شیمیایی، بار سطحی، حلالیت و شکل آنها نشات میگیرد. علیرغم کاربرد وسیع نانو مواد، کمبود جدی اطلاعات در خصوص اثر نانومواد روی سلامت انسان و محیط زیست وجود دارد.
نانوذرات از راه های مختلف (استنشاق، خوراکی، تزریقی و پوستی) به داخل بافت ها و سلولهای انسان و دیگر جانداران نفوذ کرده و به دلیل اینکه میتوانند از غشاهای زیستی عبور کنند، توان آن را دارند که بر فیزیولوژی اکثر سلولها مثل مغز و قلب و ریه اثر
بگذارند(.(2 عوامل متعددی در میزان سمیت نانوذرات
دخیل هستند که شامل خواص فیزیکی- شیمیایی مثل
اندازه، حالت انباشتگی (اشباع)، ساختار کریستالی، ترکیب
شیمیایی، شکل و حالت آنها میباشد(.(3
بعضی ازخصوصیات ویژه نانوذرات مانند اندازه خیلی کوچک آنها، مساحت بزرگ سطح و واکنش پذیری آنها
به طور بالقوه ای انسانها را در معرض خطرات جدید و
رو به رشد قرار داده است.
با کوچک شدن ماده، خواص فیزیکی و شیمیایی جدیدی در ماده ظاهر میشود که مهمترین آنها افزایش
نسبت سطح به حجم است که این امر باعث غلبه یافتن
رفتار سطح ذره به رفتارهای درونی میگردد و افزایش
واکنشپذیری ذرات نانو را سبب میشود. این خاصیت
نانوذرات در بیولوژی سلولی امکان افزیش نفوذ پذیری نانوذرات را از بین حصارهای بیولوژیکی مثل غشای
سلولی و سد مغزی خونی فراهم میکند که البته این
خاصیت نانوذرات پتانسیل زیادی را برای درمان بیمارهای
سیستم اعصاب مرکزی با استفاده از آنها به عنوان حامل دارو به وجود آورده است .(4)
در سالهای اخیر تعداد مطالعاتی که اثرات زیانآور
نانوذرات را بر سلامت انسان بررسی کرده اند به طور
چشمگیری افزایش یافته است ولی به هر حال نگرانی مربوط به اثرات بالقوه بیولوژیک و سمیت انسانی این
ذرات وجود دارد. بسیاری از مطالعات علوم پایه نشاندهنده کمبود دانش ما نسبت به این موضوع میباشد. یک تلاش همه جانبه و بین رشتهای نیاز خواهد بود تا تحقیقات ضروری برای کمک به تدوین مدلهای منظم رفتار با هرگونه خطر جدید، صورت بگیرد(.(5-6
از جمله نانوذرات میتوان به نانوذرات سیلیکا اشاره کرد که به طور گستردهای در علوم زیستی و پزشکی مورد استفاده قرار گرفته است. استفاده در بیوسنسورها، بیومارکرهای زیستی، حامل دارو، حامل DNA و درمان سرطان از موارد کاربرد این نانوذرات میباشد. به هرحال
اثرات بیولوژیک بالقوه مواجهه با این نانوذرات و
مکانیسم سمیت آن هنوز روشن نشده است.
تغییرات اندازهایو شکلی احتمالاً میتواند تاثیری بر
روی خواص سمی این نانوذره اعمال کند. در حال حاضر
تحقیقات اندکی وجود دارد که نشان میدهد نانوذرات سیلیکا دارای تاثیرات سمی بر سلولهای مختلف
میباشد(8،(7 ولی تحقیقی که نشان دهد شکلها و
اندازههای مختلف این نانوذره بر حیات سلولی تاثیر گذار هست یا نه وجود ندارد. هدف از این مطالعه تجربی-آزمایشگاهی، بررسی اثر سمیت نانوذره سیلیکا در
علی جبالی و همکاران فصلنامه علمی تخصصی طب کار/ دوره پنجم/ شماره چهارم/ زمستان 26 /92
شکلهای سیمی (Wire)، میلهای (Rod)، کروی (Spherical) و در اندازههای مختلف 20) و 50 و 100
نانومتر) بر سلول ریه رت در دو زمان مواجهه 6 و 24
ساعته با استفاده از دو تست سایتوتوکسیسیتی زیر بود(.(MTT, MTS
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-y1)-2,5diphenyltetrazolium bromide (MTT)
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl) -2-(4-sulfophenyl)-tetrazolium (MTS) ×
روش بررسی
در این تحقیق نانوذرات سیلیکا در اشکال و
اندازههای مختلف از شرکت Zyst Fanavar Shargh Co. ( ZFS Co, Iran) تهیه شد. همچنین مایع کربس و بافر سالین فسفات از گروه فیزیولوژی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد تهیه گردید. مابقی مواد که شامل محیط کشت RPMI-1640، Fetal
bovine serum (FBS)، Hanks buffered saline solution (HBSS)، ایزوپروپانول، آنزیم تریپسین، تریپان
بلو و اسید کلریدریک بودند از کمپانی مرک (آلمان) تهیه گردید.
تهیه نانوذرات سیلیکا و مشخصه یابی آنها
نانوذرات سیلیکا مورد استفاده در این تحقیق شامل
نانوذرات سیلیکا به فرم سیمی به قطر 50 و طول 500
نانومتر، نانوذرات سیلیکا به فرم میلهای در طولهای 20، 50، 100 نانومتر و نانوذرات سیلیکا به فرم کروی در قطرهای 20، 50 و 100 نانومتر بودند. همه نانوذرات قبل
از بررسی سمیت توسط میکروسکوپ الکترونی روبشی
(SEM) مدل Hitachi S-2400 مشخصهیابی گردیدند.
در مرحله بعد غلظت 500 میکروگرم بر میلیلیتر از
نانوذرات مذکور در آب مقطر تهیه گردید و به خوبی همزده شد تا سوسپانسیون یکنواختی شکل گرفت.
تهیه سلولهای ریه از رت
در این مطالعه از 2 موش صحرایی نر (نژاد (Wistar با وزن تقریبی 300 گرم که از مرکز نگهداری حیوانات
آزمایشگاهی دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد تهیه شده بود، استفاده گردید.
جهت جداسازی بافت ریه، ابتدا رت را با داروی
تیوپنتال سدیم (Sodium thiopental) به صورت تزریق داخل صفاقی با دوز 50 میلیگرم به ازای هر کیلوگرم
وزن بدن بیهوش نموده و سپس روی پد حرارتی
(صفحه (warmer فیکس نموده و درجه حرارت بدن
حیوان از طریق دمای رکتال کنترل گردید. سپس ورید
دُمی برای تزریق محلول کربس و شریان کاروتید برای
خروج خون کانوله شد. محلول کربس اکسیژنه شده را که
از قبل آماده ساخته بودیم به آهستگی و به تدریج از
طریق ورید دُمی تزریق نموده و به آهستگی خون را از
شریان کاروتید خارج مینمودیم. با این کار تمام
سلولهای خونی از بدن خارج میشد. این عمل را آنقدر انجام دادیم تا مایع خروجی با مایع ورودی تقریباً همرنگ شود که در این حالت تمام خون داخل بدن موش با مایع کربس شسته شده و مایع کربس جایگزین خون میشد. بعد از باز کردن قفسه سینه، ریه را از ناحیه نای برداشته و
چندین بار لاواژ نمودیم تا محتوای موکوسی مجاری
تنفسی به طور کامل خارج شود. سپس ریه را داخل محلول محیط کشت قرار داده و وارد مرحله جداسازی سلول شدیم. پس از جداسازی ریه، برونشها را توسط بافر سالین فسفات استریل لاواژ نمودیم. سپس ریه را
داخل محیط کشت سلولی ( RPMI-1640 with 10% (FBS قرار دادیم.
برای جداسازی سلول از بافت 5 سی سی آنزیم تریپسین %5 به بافت ریه اضافه نمودیم تا استحکام بافت
ریه کاهش یابد. پس از این مرحله، با کمک هاون استریل
بافت را به آرامی له نمودیم تا سلولها به صورت
مکانیکی جدا شود. سپس بافت خرد شده را با قدرت
400 گرم به مدت 5 دقیقه سانتریفیوژ نمودیم تا بافتهایی
که هنوز کاملاً تفکیک نشدهاند از سلولهای دیگر جدا
گردند. حال بافتهای اضافی را از سلولهای تفکیک
شده جدا نموده و دوباره عمل سانتریفیوژ را این بار با
/27 مقایسه اثر سایتوتوکسیک نانو ذرات سیلیکا در شکلها و اندازههای ....
قدرت 1500 گرم به مدت 15 دقیقه تکرار نمودیم تا آنزیم تریپسین اضافه شده و محلول محیط کشت از
سلولها جدا شود. محیط کشت حاوی سلول را از
دستگاه سانتریفیوژ خارج کرده و ته ظرف که حاوی سلولهای جدا شده بود را داخل محیط کشت جدید
اضافه نمودیم.
پس از اتمام عملیات جداسازی سلول، محیط کشت
حاوی سلول را داخل انکوباتور 37 درجه قرار دادیم.
جهت اطمینان از سالم بودن سلولها، از رنگآمیزی
تریپان بلو استفاده گردید و درصد سلولهای سالم تعیین
گردید.
مواجهه سلول ریه رت با نانوذرات سیلیکا و انجام دو تست MTT & MTS
پس از تهیه سوسپانسیون سلولی و سوسپانسیون نانوذرات سیلیکا، در هر چاهک میکروپلیت 96 تایی استریل، 100 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولهای ریوی با غلظت 2× 104 سلول در میلیلیتر را به طور جداگانه
ریخته و نیز 100 میکرولیتر از نانوذرات به طور جداگانه
اضافه شد و این مجموعه به مدت 6 و 24 ساعت در 37
درجه انکوبه گشت. سپس سلولها با بافر HBSS
شستشو داده شد و دوباره 100 میکرولیتر از محیط کشت به چاهکها اضافه گردید و این بار 25 میکرولیتر از محلول نمکی MTT و MTS در غلظت 5 mg/mL به طور جداگانه به چاهکها افزوده شد. سپس 3 ساعت در
دمای 37 درجه انکوبه گشته، و آنگاه 50 میکرولیتر از محلول ایزوپروپانول %70 به هر چاهک اضافه شد و
جذب نوری آن در طول موج 492 نانومتر قرائت گردید و درصد حیات سلولی با توجه به میزان جذب نوری
گروه تست و کنترل منفی تعیین گردید.
لازم به ذکر است در این تحقیق کنترل مثبت (با
مواجهه اسید کلریدریک 0/1 مولار) و منفی (نرمال سالین بدون نانوذرات) نیز لحاظ گردید و آزمایشات به صورت دو بار تکرار انجام شد. سپس آزمون Mann-Whitney
سطح معنیداری قلمداد گردید.
یافتهها
نتایج سمیت نانوذره سیلیکا در اشکال و اندازههای
مختلف در جدول 1 و نمودارهای 1 و 2 نشان داده شده
است. در ارائه نتایج از مخفف اسامی نانوذرات استفاده
خواهد شد که در شکل 1 نشان داده شده است. در این شکل تصاویر میکروسکوپ الکترونی نانوذرات مورد
استفاده، قابل مشاهده است.
بر اساس یافتههای این مطالعه نانوذرات با اندازه
کوچکتر دارای سایتوتوکسیسیتی بیشتری نسبت به اندازههای بزرگتر میباشند به طریقی که اندازه 20 نانومتر در هر دو شکل میلهای و کروی دارای سمیت بیشتری
نسبت به نانوذرات 50 نانومتر و 100نانومتر بودند. این
یافته در هر دو زمان مواجهه 6 و 24 ساعته و در هر دو تست MTT & MTS مشاهده شد. همچنین میزان
سمیت نانوذرهسیلیکا به شکل سیمی در اندازه 50 نانومتر تقریباً با نانوذره سلیکا به شکل میلهای و با اندازه 100 نانومتر برابر می باشد. نتایج تست MTS نشان داد که نانوذرات کروی در اندازه 20 نانومتر دارای بیشترین اثر توکسیک بر روی سلولهای ریه رت نسبت به نانوذرات میلهای و سیمی بود ولی در آزمون MTT نانوذرات میلهای در اندازه 20 نانومتر بیشترین سمیت را داشتند. از
جمله نتایج این تحقیق که حائز اهمیت است، اثر وابستگی زمان مواجهه با میزان سمیت است به نحوی که زمان انکوباسیون 24 ساعته باعث اندکی افزایش مرگ
سلولی در همه اندازهها و شکل ها شده است، ولی این
میزان افزایش نسبت به تاثیر اندازه و شکل بسیار اندک
میباشد. در آزمون MTT از نظر آماری تفاوت معناداری
بین میزان سمیت نانوذره سیلیکای میلهای در اندازههای
20 نانومتر و 100 نانومتر وجود داشت. چنین رابطهای در مورد نانوذرات سیلیکای کروی نیز دیده شد(.(P<0/05
