بخشی از مقاله
چکیده
به منظور مظالعه چند شکلی جایگاه ژنی پروتئﲔ کاپا-کازئﲔ در ﲨعیت گاو میش ﴰال ایران - جزیره میانکاله - ﳕونه هاي خون از 130 راس گاو میش رودخانه اي ﲥیه و براي استخراج DNA از روش ﳕکی ﲠینه یافته استفاده شد. واکنش زﳒﲑ ه اي پلیمراز جهت تکثﲑ یک قطعه 379 جفت بازي از اگزون و اینﱰون 4 جایگاه ژنی کاپا -کازئﲔ استفاده و سپس قطعه تکثﲑ شده بوسیله آنزﱘ هاي ﳏدودالاثر HindIII و HinfI موزد هضم قرار گرفت. براي تعیﲔ ژنوتیپ، ﳏصول حاصل از هضم آنزﳝی، روي ژل آگارز 2/5 درصد و یا پلی آکریل آمید 6 درصد الکﱰوفورز گردید. نتایج حاصل از الکﱰوفورز ﲤامی ﳕونه هاي مورد آزمون رامونومورف - BB - نشان داده، بطوریکه در هیچ یک از ﳕونه هاي تعیﲔ ژنوتیپ شده آللدیگري مشاهده نشده است. لازم به ذکر است که این نتایج با دیگر ﲢقیقاتی که تا بهحال براي تعیﲔ ژنوتیپ جایگاه ژنی کاپا-کازئﲔ در دیگر ﲨعیت هاي گاو میش در کشورهاي ﳐتلف اﳒام گرفته است مطابقت دارد. بدین معﲏ که تا به حال در ﳘه گزارشات به غﲑ از ژنوتیپ BB ژنوتیپ دیگري در ﲨعیت هاي ﳐتلف گاو میش مشاهده نشده است.
کلمات کلیدي: پلی مورفیسم، گاو میش، کاپا- کازئﲔ، RFLP-PCR
مقدمه
اصلاح نژاد حیوانات با این واقعیت آه اغلب صفات مهم اقتصادي در طبیعت به صورت پلی ژنی بوده و ﲢت تاثﲑ انواع فاآتورهاي ﳏیطی و تکاملی قرار دارند، ﳏدود میگردند. غالبا تعیﲔ ژنوتیپ هر حیوان براي صفات اقتصادي با توجه به فنوتیپ آن میسر ﳕی باشد. یکی از مزایاي علم ژنتیک مولکوﱄ، شناخت ژن هایی است که در امر انتخاب براي صفات تولیدي مفید و سود آور می باشند. مطالعات اﳒام شده روي جایگاه ژنی مرتبط به پروتئﲔ هاي شﲑ، ارتباط واریته هاي ژنتیکی آازئﲔ ها و عمل آوري آن را بیان آرده است . - 1 - گروهی از ﳏققﲔ بیان داشتند آه علاوه برتفاوت در اندازه میسل واریته A و B آاپا-آازئﲔ، آللB این ژن در مقایسه با آللA به طور معﲏ داري با خصوصیات انعقادي شﲑو ﳘچنﲔ با میزان پروتئﲔ بیشﱰ و چربی آمﱰ ارتباط دارد . - 4 -
این ﳏققﲔ با بررسی نژادهایی مثل هلشتاین، پانتانﲑو و استونی، شﲑگاوهاي با آلل B را، با داشﱳ 5 - 10 درصد تولید پنﲑ بالاتر، مناسب تر بیان آردند 3 - ، . - 5 بوون هیوس و ﳘکاران با بررسی جایگاه ژنی آاپا-آازئﲔ در نژاد هلشتاین، درصد پروتئﲔ تولیدي ژنوتیپ BB را 0/08 درصد بالاتر از ژنوتیپ AA گزارش آردند - 2 - ، در حالیکه این اثر براي مقدار پروتئﲔ معﲏ دار نبود. علاوه بر این، این ﳏققﲔ آلل A را در تولید روزانه اآثر ترآیبات شﲑ، آل مواد جامد شﲑ، تولید چربی و پروتئﲔ شﲑ مثبت ارزیابی آردند. در گاوهاي ایرشایرآلل B با مقدار بالاتر پروتئﲔ در اولﲔ شﲑدهی مرتبط بوده است، در حالیکه گزارش شده است در گاوهاي هلشتاین این آلل بر روي ترآیب پروتئیﲏ اثر دارد و هیچگونه اثري روي غلظت پروتئﲔ ندارد . - 3 -
گزارش شده است آه آلل هاي A2 بتا-آازئﲔ و یا B آاپا-آازئﲔ به تنهایی روي تولید پروتئﲔ یا شﲑ اثري نداشته اما اثرترآیﱯ هاپلوتیپ آلفا، بتا و آاپا-آازئﲔ میزان پروتئﲔ را افزایش می دهد و در نتیجه میزان تولید شﲑ در اولﲔ شﲑدهی به میزان 86 آیلو افزایش داشته است 6 - ،. - 4 بوچر و ﳘکاران اثر هاپلوتیپ - αS1 CN-B/βCN-A1/KCN-B - را روي درصد پروتئﲔ شﲑ هلشتاین و براون سوئیس و درصد چربی براون سوئیس معﲏ دار گزارش آردند . - 1 - این هاپلوتیپ در هر دو نژاد روي تولید شﲑ اثر منفی داشته، اما این اثر در نژاد هلشتاین معﲏ دار نبوده است. علاوه بر این در بﲔ هاپلوتیپ هایی آه فقط از نظر آاپا -آازئﲔ با هم فرق داشتند، آللB آاپا-آازئﲔ روي درصد پروتئﲔ اثر معﲏ دار داشت. این ﲢقیق به منظور شناسایی پلی مورفیسم در جایگاه ژنی کاپا -کازئﲔ در ﲨعیت گاو میش ﴰال ایران - جزیره میانکاله - اﳒام گرفته است.
مواد و روش ها
در این ﲢقیق از 130 رأس گاو میش به میزان 5 میلی لیﱰ خون از طریق ورید وداج و با استفاده از ونوجکت حاوي ماده ضد انعقاد اﳒام گرفت. ﳕونه گﲑي بطور تصادﰲ و از ﲤام نواحی جزیره میانکاله صورت گرفت. سپس خون هاي مورد نظر در داخل یخ به آزمایشگاه منتقل و تا زمان استخراج در فریزر -20 درجه سانتیگراد نگهداري شد. جهت استخراج DNA از روش ﳕکی ﲠینه یافته و براي تعیﲔ آمیت و کیفیت DNA استخراج شده از اسپکﱰوفتومﱰي و ژل آگارز 0/8 درصد و جهت مشاهده ﳏصولات PCR از ژل آگارز %1/5 استفاده شد. تواﱄ پراﳝرهاي مرتبط به جایگاه ژنی آاپا-آازئﲔ - پیپالیا و ﳘکاران - در جدول زیر نشان داده شد - جدول . - 1واکنش PCRبا استفاده از 50-100نانوگرم DNA ژنومی، 0/2 میلیمولارdNTP، 2/5 میلی مولار MgCl2، 0/5میکرومول از هر یک از پراﳝرها،بافرPCRو یکواحد آنزﱘ تک پلیمرازدر حجم 25 میکرولیﱰ اﳒام گرفت.هضم ﳏصول PCR توسط10 واحد از هر یک از آنزﱘ هاي HinfI و یا HindIII در دماي 37 درجه سانتیگراد به مدت 1 ساعت روي ژل آگارز %2/5 یا ژل آآریل آمید %6 اﳒام شد. تغیﲔ آلل ها براساس وجود یا عدم وجود نقطه برشی درجایگاه هاي مورد نظر و فراوانی ژنوتیپی و آللی با رویت و ﴰارش مستقیم آلل ها ﳏاسبه گردید.
نتایج و ﲝث
تکثﲑ قطعه اي اﳒام واکنش PCR با استفاده از پراﳝر اختصاصی منجر به به طول 379 جفت بازي از جایگاه ژنی کاپا-کازئﲔ گردید. ﳏصول حاصل از هضم روي ژل آگارز %2/5 الکﱰوفورز گردید. تیمار قطعه مورد نظر باآنزﱘ ﳏدودالاثر HindIII منجر به شناسایی هر یک از آلل هاي A و یا B می گردد. در صورت عدم وجود جایگاه برش قطعه مورد نظر دست ﳔورده باقی مانده - آلل - A، اما در صورت شناسایی یک نقطعه برش منجر به تولید دو قطعه هر یک به اندازه هاي 225 و 154 جفت بازي - آلل - B خواهد شد. در مطالعه حاضر در ﳘه افراد تعیﲔ ژنوتیپ شده توسط آنزﱘ HindIII دو باند به طول 225 و 154 جفت باز آشکار گردید.
نتایج هضم آنزﳝی نشان داد که در قطعه مورد نظر هیچ جهشی رخ نداده و ﳘه افراد اراي ژنوتیپ مونومورف - BB - بوده اند. تیمار قطعه مورد نظر با آنزﱘ ﳏدودالاثر HinfI نیز منجر به شناسایی هر یک از آلل هاي A و یا B می گردد. در در تیمار توسط این آنزﱘ نیز در صورت عدم وجود جایگاه برش قطعه مورد نظر دست ﳔورده باقی مانده - آلل - A، اما در صورت شناسایی یک نقطعه برش منجر به تولید دو قطعه هر یک به اندازه هاي 288 و 91 جفت بازي - آلل - B خواهد شد. در مطالعه حاضر در ﳘه افراد تعیﲔ ژنوتیپ شده توسط آنزﱘ HinfI دو باند به طول 228 و 91 جفت باز آشکار گردید. نتایج هضم آنزﳝی نشان داد که در قطعه مورد نظر هیچ جهشی رخ نداده و ﳘه افراد اراي ژنوتیپ مونومورف - BB - بوده اند.
استفاده از آنزﱘ هاي ﳏدودالاثر HinfI و یا HindIII براي جایگاه ژنی کاپا-کازئﲔ در گاو هلشتاین و یا دیگر نژاد در گاو منجر به شناسایی چند شکلی شده است که توسط گروه هاي ﲢقیقاتی زیادي گزارش شده است 7 - ، . - 6 اما تا به حال چند شکلی در این جایگاه ژنی در ﲨعیت گاو میش گزارشی به چاپ نرسیده است. براي مثال اﳒام کار ﲢقیقاتی روي ﲨعیت گاو میش برزیل - 8 - ، ﲨعیت گاو میش هندي - 10 - و گاو میش مصري - 9 - منجر به شناسایی هیچ پلی مورفیسمی نشده وﳘه افراددر این ﲨعیت ها فقط ژنوتیپ مونومورف - BB - را نشان دادند.درﲢقیقی که براي شناسایی پلی مورفیسم در جایگاه ژنی کاپا-کازئﲔ درﲨعیت گاو میش رودخانه اي غرب کشور درایران اﳒام گرفته است نیز ﳘهﳕونه ها داراي ژنوتیپ مونومورف BB بودند. با توجه به نتایج بدست آمده در این مطالعه و دیگر گزارشات منتشر شده می توان بیان داشت که ژن کاپا-کازئﲔ در گاو میش مونومورف بوده و توسط یک آلل کنﱰل می گردد.
