بخشی از مقاله
مقدمه
کلستاز ازنظر فیزیولوژیک، به توقف یا کاهش جریان صفرا در کانالیکولهاي صفراوي گفته میشود .(Reyes et al., 1993) کلستاز براساس منشأ شامل دو نوع داخلکبدي و خارجکبدي است. کلستاز داخلکبدي بر اثر اختلال در عملکرد هپاتوسیتها وکلستاز خارج کبدي به دلیل عواملی نظیر سنگهاي صفراوي، تومورهاي پانکراس و کیسهصفرا ایجاد میشود (Moezi et .al., 2004) اثرات اولیه کلستاز شامل افزایش غلظت صفرا در سرم (که در غلظتهاي بالا سمی است) و کاهش ترشح صفرا به داخل روده است (Bouscarel et al., 1998) که به وخیم-ترشدن بیماري کبدي و ایجاد بیماري سیستمیک منجر میشود .(Kountouras et al., 1984) درنهایت با پیشرفت بیماري فیبروز و سیروزکبدي اتفاق میافتد .(Moezi et al., 2004) کلستاز موجب افزایش تولید پروستاگلاندینها، کلسترول، بیلی-روبین، آلکالین فسفاتاز و افزایش سطح نمکهاي صفراوي در خون میشود. کلستاز همچنین باعث اندوتوکسمی، افزایش تولید نیتریک اکساید (Moezi et al., 2004)، ایجاد تغییرات عروقی، افزایش سطح اپیوئیدهاي درون زاد (Moezi et al., 2004; Borhani et al., 2005) و کاهش حافظه نیز می-
شود (Hajrasouliha et al., 2004; Hasanein et al.,
.2007; Zarrindast et al., 2012) کلستاز در هنگام بارداري
و نوزادي مشاهده گردیده است (Molina et al., 1998;
.Jones et al., 1999; Matthai et al., 2001) کلستاز بارداري بر اثر نقص ژنتیکی ایجاد و موجب نقص مادرزادي می-شود و کلستاز نوزادي بر اثر آترزي مجراي صفراوي و هپاتیت آیدیوپاتیک به وجود میآید. تظاهرات کلاسیک کلستاز شامل زردي و خارش است. علاوه بر آن، تظاهرات بالینی دیگري مانند خستگی، اختلالات استخوانی (May et al., 1995)، برادي-کاردي، تغییر در عملکرد تنفسی و ریهها و نارسایی کلیه نیز مشاهده میشود (Heidenreich et al., 1987; Gaskari et
.al., 2002; Farajzadeh Deroee et al., 2010)
هیپوتالاموس منطقه کوچکی از مغز است که در عقب و پایین مغز جلویی و در جلو و بالاي مغز میانی قرار دارد. هیپوتالاموس
78/78 Nova Biologica Reperta 1 (2): 77-85 ( 2015)
بهواسطه حفرة بطن سوم به طور قرینه به دو نیمه راست و چپ تقسیم میشود و کف و دیوارههاي بطن سوم را تشکیل می-دهد. در هیپوتالاموس هستههایی وجود دارند که از اجتماع پریکاریون نورونها به وجود آمدهاند. کلیه اعمال و فعالیتهاي هیپوتالاموس وابسته به یکی از این هستهها یا تعدادي ازآنهاست. این هستهها ازطریق اعصاب و عروق با غدة هیپوفیز ارتباط دارند. دو هسته مجاور بطنی (PVN) و فوق بصري (SON) در اخذ آب نقش دارند و با آزادسازي هورمون وازوپرسین میزان جذب آب بدن را افزایش و احساس تشنگی را از بین میبرند. این هسته هاي هیپوتالاموسی از سلولهاي درشت (ماگنوسلولار) و سلولهاي کوچک (پاروي سلولار) تشکیل
شدهاند .(Oryan & Valizadegan, 2009)
نوشیدن آب پاسخی به کاهش حجم خون است که بهوسیله دو سازوکار متفاوت آغاز میشود؛ یک نوع آن زمانی است که مکانورسپتورهایی پیام تحریکی خود را براي نوشیدن ازطریق هسته منزوي (solitary tract) به مراکز هیپوتالاموسی ارسال میکنند. مرکز تنظیمی مهم دیگري که در اخذ آب نقش دارد، سیستم رنین-آنژیوتنسین است که کلیهها با کاهش فشار خون رنین را به جریان خون آزاد میکنند. رنین مسیري را فعال می-کند که رفتار نوشیدن آب را با تحریک سلولهاي ماگنوسلولار SON و PVN موجب میشود و در این مورد آنژیوتنسین II همانند نوروترنسمیتر عمل میکند (Otsubo et .al., 2010) همچنین نشان داده شده است که تحریک PVN اخذ آب را افزایش میدهد .(Takahashi et al., 2001) با توجه به اینکه مرکز تنظیم تشنگی و نوشیدن در هستههاي مجاور بطنی و فوقبصري قرار دارد و اخذ آب در هنگام کلستاز کاهش مییابد (Mani et al., 2001)، هدف مطالعه حاضر بررسی تأثیر کلستاز بر تغییرات بافتی هستههاي مجاور بطنی و فوق بصري هیپوتالاموس است.
مواد و روشها حیوانات و شرایط آزمایش
این مطالعه در آزمایشگاه فیزیولوژي جانوري دانشکدة علوم زیستی دانشگاه خوارزمی تهران انجام شد. به این منظور 21 سر
یافتههاي نوین در علوم زیستی جلد 1، شمارة 77-85 :2
موش صحرایی آزمایشگاهی نر نژاد ویستار با وزنی حدود -250 200 گرم و سن متوسط هشتهفته، در مرکز تکثیر حیوانات دانشگاه خوارزمی، در وضعیت کنترلشده با دماي 20 -25 درجه سانتیگراد و سیکل 12 ساعت روشنایی و12 ساعت تاریکی قرار گرفتند. کلیه موشها دسترسی آزادانه به آب آشامیدنی و غذاي مخصوص حیوانات آزمایشگاهی داشتند و در وضعیت یکسان نگهداري شدند.
جراحی کلستاز
موشها به سه گروه هفتتایی کنترل، شم (جراحی ساختگی بدون بستن مجرا) و کلستاز (بستن مجراي صفراوي) تقسیم شدند. براي جراحی شم و کلستاز، ابتدا موشها با استفاده از کتامین هیدروکلراید 10درصد و زایلازین 2درصد بیهوش شدند. سپس بهوسیله الکل سطح شکمی درست در زیر جناغ تا 3 سانتیمتر پایینتر از استخوان جناغ ضدعفونی شد و موهاي این ناحیه با تیغ تراشیده و پوست و عضله در دو مرحله جدا برش زده شد. سپس با کمک پنس سر کج مجراي صفراوي مشترك از زیر کبد خارج شد و بعد از جداسازي رگ خونی، دو طرف مجرا با نخ سیلک بسته و درنهایت بین دو گره بهوسیله قیچی بریده و مجرا قطع شد. در گروه شم تمام مراحل پیشگفته براي عمل کلستاز صورت گرفت، ولی مجرا بسته نشد. دو روز بعد از مسدودکردن مجراي صفراوي در حیوانات نشانههاي کلستاز (زردي، ادرار تیره و اسهال چرب) مشاهده شد که به عنوان شاخص ایجاد کلستاز در نظر گرفته شد.
روش بررسی بافتی
دو و چهارهفته پساز کلستاز، براي خارجکردن مغز، ابتدا سر حیوان بیهوش از ناحیه گردن جدا و پساز قیچیکردن پوست و عضلات، سطح جمجمه باز شد و این عمل بدون آسیب به مغز و درنهایت دقت انجام گرفت. مغزهاي جداشده پساز شستوشو در سرم فیزیولوژي در محلول فیکساتیوفرمالین -10 درصد قرار گرفت تا به طور کامل تثبیت شوند. مراحل آماده-سازي شامل آبگیري با درجات صعودي الکلاتیلیک و شفافسازي بهوسیله تولوئن بود. بافت پس ازشفافسازي به حمام پارافین منتقل شد و پساز قالبگیري با پارافین
79/79 Nova Biologica Reperta 1 (2): 77-85 ( 2015)
(Merck) از آن برشهاي 6 میکرونی گرفته شد. رنگآمیزي با هماتوکسیلین-ائوزین (H&E) انجام شد و روي لامها، لامل چسبانده شد. برشهاي مقاطع بافتی مغز در ناحیه هیپوتالاموس توسط میکروسکوپ نوري (Zeiss) تحت بررسی قرارگرفت و با استفاده از میکروگرافهاي تهیهشده از این لامها، اختلافات بافتی گروههاي تجربی در مقایسه با گروه شاهد بررسی شد. به منظور شمارش سلولی از نرمافزار ImageJ استفاده شد .(Lavazza et al., 2010) ضخامت هستههاي SON و PVN، با قراردادن گراتیکول در اوکولر میکروسکوپ نوري از ابتدا تا انتهاي هستهها برحسب میکرومتر اندازهگیري شد.
روش و ابزار گردآوري اطلاعات
محاسبهها با استفاده از تحلیل واریانس یکطرفه براي مقایسه گروهها توسط نرمافزار SPSS انجام شد. بعد از هر F معنیدار، تحلیل به کمک Post hoc tukey, test ادامه یافت. ازلحاظ آماري p کمتر از 0/05 معنی دار فرض شد.
نتایج
الف – یافتههاي کیفی: مشاهدات میکروسکوپی نشاندهندة تغییرات بافتی در هستههاي فوقبصري (SON) و مجاور-بطنی((PVN هیپوتالاموس در حیوانات کلستاز شده است. در موشهاي کلستاتیک تراکم نورونهاي تشکیلدهندة هستههاي SON و PVN کاهش یافته و مورفولوژي سلولهاي تشکیل-دهنده تغییر کرده است و سلولها کوچک و چروکیده شدهاند. همچنین هتروکروماتینهشدن سلولها و ائوزینوفیلهشدن بافت هستهها مشاهدهشد. در شکل 1 مقایسه اسلایدها نشان میدهد که هیچ تغییري در بافت هسته SON در گروههاي کنترل و شم 1A)، B، و (C قابل مشاهده نیست. درصورتیکه با بررسی این دو گروه با 1D (گروه کلستاتیک)، فاصلهگرفتن سلولها در اثر نکروز قابل رؤیت است. همچنین در شکل 2 عکس هاي A، B، و C که گروههاي کنترل و شم هسته PVN را نشان میدهند، تغییري در ساختار این هسته ایجاد نشده است، درصورتیکه در 2D، که نمونه کلستاتیک است، هتروکروماتینهشدن هستهها و ایجاد فضاي خالی اطراف سلولها نشان مرگ سلولی است که در حالت کلستاتیک به میزان زیادي در بافت هسته PVN
یافتههاي نوین در علوم زیستی جلد 1، شمارة 77-85 :2
مشاهده میشود. انسجام بافتی دو گروه قبل نیز در این گروه مشاهده نشد. با مقایسه شکل 3 کلستاز دوهفتهاي و چهارهفتهاي افزایش تغییرات بافتی بهخصوص در هسته PVN دیده میشود.
80 Nova Biologica Reperta 1 (2): 77-85 (2015) 80/
شکل– 1 هستههاي فوقبصري در هیپوتالاموس گروه کنترل، اسلاید A (بزرگنمایی (×10، اسلاید B (بزرگنمایی (×100، گروه شم اسلاید C (بزرگنمایی (×100، گروه کلستاز اسلاید D (بزرگنمایی .(×100 با مقایسه تصاویر گروه کنترل و گروه شم تغییر خاصی قابل مشاهده نیست، ولی گروه کلستاز با کاهش تراکم بافتی، نکروز و هتروکروماتینهشدن هسته فوقبصري همراه است. هسته فوق بصري: SON، اپتیک کیاسما: OC، بطن سوم : Vlll (رنگ آمیزي .(H&E
Fig. 1. Supra optic nucleus of hypothalamus, A: Control (10X), B: Sham (100X), C: Cholestasis (100X). Brain tissue necrosis and wrinkle chromatic nuclei in supra optic nucleus in cholestatic rats were increased, but in the sham and
control rats no changes were observed (H&E).
شکل -2 هستههاي مجاوربطنی در هیپوتالاموس گروه کنترل، اسلاید A (بزرگنمایی (×40 و اسلاید B (بزرگنمایی (×100، اسلاید C گروه شم (بزرگنمایی (×100، اسلاید D گروه کلستاز (بزرگنمایی .(×100 با مقایسه بافت گروه کنترل و گروه شم تغییر خاصی قابل مشاهده نیست ولی گروه کلستاز با کاهش تراکم بافتی، نکروز و هتروکروماتینهشدن هسته مجاور بطنی همراه است. هسته مجاوربطنی PVN: ، بطن سوم : .Vlll (رنگ آمیزي H&E، بزرگنمایی ×100 و . (× 400
Fig. 2. Para ventricular nucleus of hypothalamus, A: Control (40X), B: Sham (100X), C: Cholestasis (100X). Brain tissue necrosis and wrinkle chromatic nuclei in Para ventricular nucleus in cholestatic rats were increased, but in the
sham and control rats no changes were observed (H&E).
