بخشی از مقاله
مقدمه پدیدهی اتوایمیون در این بیماری نیز مشاهده شده است۲. به
طوری که وجود اتوآنتیبادیها علیه برخی اتوآنتیﮊنهای
دیابت نوع ۲ یا iNIDDM، یک بیماری شایع و مزمن سلولهای β در جزایر لانگرهانس پانکراس در این بیماران
است که سالانه جان میلیونها نفر را در دنیا میگیرد و هر گزارش شده است. ۵-۳ این اتوآنتیبادیها حتی سالها قبل از
ساله نیز بر این تعداد افزوده میشود. تاکنون ماهیت و بروز علایم بالینی دیابت در پلاسمای این افراد مشاهده
چگونگی بروز این بیماری کاملاﹰ شناخته نشده است۱. صرف شدهاند.۶ عمدهترین این اتوآنتیبادیها ii ICA در %۳۳-۰۱
نظر از دلایل متعددی که برای بروز آن ذکر میشود، دخالت
i- Non Insulin Dependent Diabetes Mellitus ii- Islet Cell Antibodies
۲۳۳ مجلهی غدد درونریز و متابولیسم ایران دورهی دهم, شمارهی ۴، آبان ۷۸۳۱
بیماران دیابتی نوع۲، آنتیبادی بر ضد iIA-2 در %۲۱ افراد۳، آنتیبادی بر ضد ii GAD در ۳/۰۳% افراد و iiiIAA در
۸/۴۳% بیماران۷ است.
در سالهای اخیر، مطالعههای زیادی روی آنتیبادیهای دارای خاصیت کاتالیتیک (آبزیمها) انجام شد که ارتباط مستقیمی با بروز برخی بیماریها دارند. نام آبزیمiv از دو
واﮊهی آنزیم و آنتیبادی گرفته شده است. اولین مثال از چنین آنتیبادیهایی، IgG یافت شده در پلاسمای بیماران آسمی با فعالیت هیدرولیز کننده vVIP است۸ و به دنبال آن
تنوع وسیعی از آنتیبادیهای دارای خاصیت کاتالیتیک، در افراد با انواع بیماریهای خودایمن مانند viMS ۹ و لوپوس۰۱ با فعالیت DNAase، RNAase، پپتیدازی، پروتئازی و
آمیلازی۳۱-۱۱ گزارش شده است. بر اساس مطالعههای وسیع انجام شده در این زمینه، آنتیبادیهای کاتالیتیک نقش مهمی در ایجاد شرایط پاتولوﮊی و بیماری خودایمن دارند.۰۱ با توجه به دخالت پدیدهی اتوایمیون در بیماری دیابت نوع ۲، احتمال حضور آنتیبادیهای کاتالیتیک در پلاسمای افراد دیابتی نیز مطرح شده است.
تاکنون هیچ گزارشی در مورد اینکه در بیماران دیابتی، این آنتیبادیها چرا و چگونه به وجود میآیند و نقش آنها در بروز دیابت چیست، منتشر نشده است.۴۱،۴،۳ هدف از مطالعهی حاضر، بررسی حضور آنتیبادیهای کاتالیتیک در پلاسمای افراد دیابتی و اثر آنها بر انسولین بود.
مواد و روشها
بررسی حاضر در ۳ بیمار مبتلا به دیابت نوع ۲ و ۷ هفت فرد سالم به عنوان گروه شاهد انجام گرفت. ۳ بیمار مذکور در دو اندازهگیری، قند خون ناشتای بیشتر از ۶۲۱ میلیگرم در دسیلیتر داشتند (کیت گلوکز، روش آنزیمی گلوکز اکسیداز، شرکت پارسآزمون، تهران، ایران، دستگاه اتوآنالایزر، سلکترای ۲، مرک، هلند). درصد ضریب تغییرات درونآزمونی سنجش قند ۱/۲% بود. هیچکدام از ۳ فرد بیمار برای کنترل قند خون از انسولین استفاده نمیکردند. داروهای
i-Islet antigen-2 ii- Glutamic Acid Decarboxylase iii- Insulin Autoantibodies iv - Abzyme v- Vasoactive Intestinal Peptide vi- Multiple Sclerosis
کاهندهی قند خون (متفورمین، گلیبنکلامید) قادر به کنترل میزان قند افراد مذکور بود. حضور آنتیبادی ضد اتوآنتیﮊنهای سلولهای β جزایر لانگرهانس با استفاده از کیت الایزا کیفی ( IAA kit, DRG Diagnostics, Marburg, (Germany بررسی شد. افراد شاهد از بین افرادی انتخاب
شدند که سالم بوده، قند خون ناشتای کمتر از ۰۰۱ میلیگرم در دسیلیتر داشتند، و علایم بالینی دیابت نداشتند و همچنین بر خلاف گروه مورد، آنتیبادیهای ضد جزایر لانگرهانس در آنها یافت نشده بود.
برای تخلیص آنتیبادیهای موجود در پلاسما، ابتدا پروتئینهای موجود در پلاسمای ۰۱ داوطلب به طور جداگانه با آمونیوم سولفات اشباع (%۰۵) رسوب داده و سپس با کمک ستون کروماتوگرافی تمایلی پروتئین G (تهیه شده از شرکت (Amersham Pharmacia Biotech و ﮊل فیلتراسیون با سفاکریل S300 (تهیه شده از شرکت (Merck، آنتیبادیها
تخلیص شدند. سپس ایمونوگلوبولینهای تخلیص شده، در بافرviiPBS با pH ۲/۷ در دمای ۴ درجهی سانتیگراد دیالیز
شدند.
خلوص آنتیبادیهای جدا شده با روش SDS-PAGE
تأیید شد. در این روش پروتئینها بر اساس تفاوت وزن مولکولی از هم تفکیک میشوند. خلوص حاصل در شرایط احیایی (با افزودن -β مرکاپتواتانول که باندهای دیسولفیدی
را احیا و در نتیجه دو زنجیرهی انسولین را از یکدیگر جدا میکند) و غیراحیایی (بدون افزودن -β مرکاپتواتانول) با استفاده از روش Laemmli ۵۱ و رنگآمیزی نیترات نقره و سپس وسترن بلات با استفاده از روش Towbin و
همکاران۶۱ تأیید شد. برای این منظور پس از انجام الکتروفورز، انتقال پروتئینها به کاغذ نیتروسلولز انجام شد. سپس مرحلهی بلوک کردن با ۱% viiiBSA در PBS با pH ۲/۷
به مدت ۱ ساعت انجام شد. بعد از آن کاغذ نیتروسلولز با
Anti human IgG نشاندار با ixHRP (شرکت (Sigma به مدت ۵/۱ ساعت در دمای اتاق مجاور شد. باندهای IgG پس از افزودن mg/mL ۵/۰ دیآمینوبنزیدین و ۵۰/۰%
پراکسیدهیدروﮊن به مدت ۰۱ دقیقه آشکار و مشخص شد که هیچگونه آلودگی همراه آنتیبادیها وجود ندارد. برای تعیین غلظت آنتیبادیها از طیفسنجی UV استفاده شد.
vii - Phosphate Buffered Saline viii - Bovine Serum Albumin ix - Horseradish Peroxidase
ملیحه محمدی و همکاران آنتیبادیهای کاتالیتیک در دیابت نوع ۲ ۳۳۳
خاصیت پروتئازی آنتیبادیها با روش ﮊل ـ زیموگرام با استفاده از ﮊلاتین (با غلظت نهایی %۱/۰) به عنوان سوبسترا انجام گرفت. پس از الکتروفورز، ﮊل در بافر تریس mM ۰۵
و اسیدیتهی ۶/۹ به مدت ۴۲ ساعت در دمای ۷۳ درجهی سانتیگراد قرار گرفت. برای آشکار شدن باندهای دارای فعالیت پروتئازی، ﮊل با رنگ کوماسیبریلیانت بلو R-250
۵/۰% رنگآمیزی و با متانول ـ اسیداستیک ـ آب به نسبت (۵:۱:۴) رنگبری شد.
از انسولین رگولار نوترکیب انسانی، (ساخت شرکت داروسازی اکسیر، بروجرد، ایران) استفاده شد. هر ویال انسولین محتوی U ۰۰۱ (واحد) انسولین در هر میلیلیتر بود. هر واحد انسولین معادل 7g ۵/۵۴ انسولین خالص است. در
هر ویال انسولین مواد نگهدارنده (متاکروزول و گلیسرول) وجود دارد و فاقد هر نوع پروتئین دیگری است. برای به دست آوردن غلظت مناسبی از انسولین که روی ﮊل قابل مشاهده باشد، محتویات ویال انسولین رگولار mL) ۰۱) به
کیسهی دیالیز مخصوص انسولین با برونده ۲ کیلودالتون منتقل شد و سپس با سفادکس ۰۰۲ G- آبگیری شد.
برای بررسی اثر آنتیبادیها روی انسولین، سه غلظت مختلف از آنتیبادی 7g/mL) ۵۱، 7g/mL ۵۴، 7g/mL ۵۷)
به همراه غلظت ثابتی از انسولین انتخاب شد. به همهی ویالهای حاوی آنتیبادی به اضافهی انسولین و ویالهای شاهد (آنتیبادی بدون انسولین، انسولین شاهد بدون آنتیبادی) سدیم آزید ۲۰/۰% به عنوان نگهدارنده ضد قارچ افزوده شد تا از تخریب میکروبی انسولین و آنتیبادیها جلوگیری به عمل آید. سپس نمونهها به مدت ۶ روز در انکوباتور با دمای ۷۳ درجهی سانتیگراد قرار گرفتند. در نهایت با استفاده از الکتروفورز ﮊل آکریل آمید اسید استیک ـ اوره گرادیان (%۵۱ و %۲۱) اثر آنتیبادیها روی انسولین مورد بررسی قرار گرفت. برای آشکارشدن بهتر باندها، رنگآمیزی نیترات نقرهی ﮊلها نیز انجام شد.
یافتهها
گروه دیابتی مورد دارای قند پلاسمای بیشتر از ۶۲۱ میلیگرم در دسیلیتر و افراد گروه کنترل قند پلاسمای کمتر از ۰۰۱ میلیگرم در دسیلیتر داشتند. اتوآنتیبادیها در گروه مورد با کیت کیفی مذکور مثبت و در افراد گروه شاهد،
منفی بودند. نتیجهی خلوص آنتیبادیهای موجود در پلاسمای ۳ بیمار دیابتی و ۷ نمونهی شاهد، با ستون کروماتوگرافی تمایلی پروتئین G و ﮊل فیلتراسیون با روش SDS-PAGE روی ﮊل %۵/۲۱ در شرایط غیراحیایی
(شکل۱-الف) و احیایی (شکل۱- ب) نشان داده شده است. در شرایط احیایی ۲ زنجیرهی سبک و سنگین ایمونوگلوبولینها از هم جدا میشوند. رنگآمیزی نیتراتنقره این ﮊلها نیز انجام شد که در اینجا نشان داده نشدهاند.
شکل ۱ - الف
شکل ۱ - ب
شکل۱- SDS-PAGE آنتیبادیهای خالص شده با پروتئین G در شرایط غیراحیایی (الف) و احیایی (ب) بر
روی ﮊل %۵/۲۱ و رنگآمیزی شده با کوماسی بلو. ستونهای ۱ تا ۳ مربوط به بیماران دیابتی و ستونهای۴ تا ۷ مربوط به نمونههای شاهد میباشند . در شکل ۱- ب، ستون M مربوط به مارکر وزن مولکولی پروتئین است.
همانطور که در شکل ۱ مشاهده میشود، در شرایط احیایی، باندهایی با وزن مولکولی پایین در نمونههای خالص شده وجود دارد که از نظر وزن مولکولی معادل ۵۲ و ۵۵
۴۳۳ مجلهی غدد درونریز و متابولیسم ایران دورهی دهم, شمارهی ۴، آبان ۷۸۳۱
کیلودالتون هستند این باندها در شرایط SDS-PAGE
غیراحیایی از بین رفته و فقط در مورد یک بیمار دیابتی (شکل ب، ستون۳ ) باندهای اضافی مشاهده میشود. نتیجهی بررسی این سؤال که »آیا این باندها در اثر خودتخریبی آنتیبادیها ایجاد شدهاند یا در اثر آلودگی«، با استفاده از روش وسترن بلات در شرایط احیایی و غیراحیایی، با استفاده از Anti human IgG در شکل ۲ نشان داده شده
است. نتیجهی ذکر شده با انجام آزمون وسترن بلات تأیید شد و نشان داد که همهی این باندها قطعههای آنتیبادی هستند و در نتیجهی آلودگی ایجاد نشدهاند.
شکل ۲ - الف
وسترنبلات مربوط به آنتیبادیها نیز در شرایط غیراحیایی (شکل ۳- ج) و احیایی (شکل ۳-د) انجام شد.
شکل۳- الف شکل۳- ب
شکل ۲ - ب
شکل ۲- وسترن بلات آنتـی بـادیهـای تخلـیص شـده در شرایط غیراحیایی (الف) و احیایی (ب) با استفاده از Anti .human IgG ستونهای ۱ تا ۳ مربوط به افراد دیابتی و
۴ تا ۷ مربوط به نمونههای شاهد هستند. باندهای اضافی در ستون ۳ قطعههـای آنتـیبـادی هـستند کـه بـا Anti human IgG آشکار شدند.
در شکل ۳ نتیجه فرآیند جداسازی IgG کاملاﹰ خالص، آنتیبادیهای خالص شده با ستون تمایلی پروتئین G، از
ستون ﮊل فیلتراسیون به عنوان نمونه آورده شده است. خلوص آنتیبادیها در شرایط غیراحیایی (شکل ۳-الف) و احیایی (شکل ۳-ب)، روی ﮊلآکریلآمید ۵/۲۱% با رنگآمیزی نیترات نقره نشان داده شدهاند. برای تأیید یافتههای حاصل،
شکل۳- ج شکل۳- د
شکل۳- رنگآمیـزی نیتـرات نقـره مربـوط بـه ﮊل SDS-PAGE آنتی بادیهای تخلیص شده دو نمونه ی شاهد بـا ستون تمایلی پروتئین - G و سـپس ﮊل فیلتراسـیون بـا سفاکریل S-300 در شرایط غیـر احیـایی (الـف) و احیـایی
(ب). اشکال (ج) و(د) به ترتیب مربـوط بـه وسـترن بـلات آنتیبـادیهـای همـان دو فـرد در شـرایط غیـر احیـایی و احیایی است.
برای سنجش خاصیت پروتئازی آنتیبادیها از روش ﮊل- زیموگرام با استفاده ازسوبسترای ﮊلاتین استفاده شد. آنتیبادیها به مدت یک هفته در انکوباتور با دمای ۷۳ درجهی سانتیگراد قرار گرفتند و فعالیت پروتئازی آنها در مقایسه با آنتیبادیهای انکوبه نشده سنجش شد. یافتهها نشان دادند که آنتیبادیهای انکوبه نشدهی افراد بیمار و شاهد، خاصیت پروتئازی نشان نمیدهند ولی مشاهدهها در مورد آنتیبادیها پس از یک هفته انکوباسیون، نشان داد که فعالیت پروتئازی در هر سه بیمار در مقایسه با
ملیحه محمدی و همکاران آنتیبادیهای کاتالیتیک در دیابت نوع ۲ ۵۳۳
آنتیبادیهای انکوبه نشده و آنتیبادیهای افراد شاهد، به شدت افزایش یافته است در حالی که این پدیده فقط در مورد یکی از نمونههای شاهد مشاهده شد که یافتهها در شکل ۴ آورده شده است.
