بخشی از مقاله
چکیده
به منظور تعیین خصوصیات فنوتیپی و تنوع ژنوتیپی عامل گال طوقه مو، گل رز و چغندر قند جداسازي عامل بیماري توسط محیط هاي NA، DIM agar، 1A و RS انجام گرفت. بر اساس آزمون هاي بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی و آزمون هاي افتراقی، همچنین استفاده از محیط هاي کشت انتخابی شامل 1A و RS، جدایه هاي مذکور به عنوان A. vitis - جدا شده از مو - و - جدا شده از گل رز و چغندرقند - تشخیص داده شدند. براي تشخیص بیماري زایی جدایه ها نیز از آغازگرهاي اختصاصی استفاده شد و تمام جدایه ها باند 224 جفت بازي را تکثیر کردند. آزمون بیماري زایی روي گیاهان کالانکوئه، گوجه فرنگی و آفتابگردان انجام و منجر به تولید گال در این گیاهان گردید.
در بررسی آزمون ERIC-PCR تنوع زیادي دربین جدایه ها مشاهده گردید، و جدایههاي به دست آمده از مناطق مختلف استان هاي فارس و کهگیلویه و بویراحمد به دو گروه کلی تقسیم شدند. بر اساس این تحقیق گروه بندي بر اساس خصوصیات ژنوتیپی تا حدودي با گروه بندي بر اساس خصوصیات فنوتیپی مطابقت داشته و آزمون هاي فنوتیپی و ERIC-PCR به خوبی توانستند گونه هاي A. vitis وA. tumefaciens را از هم تفکیک نمایند.
کلمات کلیدي: گال طوقه، Agrobacterium، ERIC-PCR
مقدمه
باکتري یک جنس از خانواده بوده و بر اساس خصوصیات ریبوزومی در زیر رده قرار دارد. گونه هاي مختلف باعث بیماري گال طوقه و ریشه شده که در نواحی معتدل، به خصوص کشورهاي مدیترانه اي گسترش دارد. این بیماري در سرتاسر جهان وجود داشته و عمدتا درختان هسته دار، دانه دار، مو، گل هاي رز و تعدادي از گیاهان زینتی را تحت تاثیر قرار می دهد. بیماري گال طوقه و ریشه عمدتا در نهالستان ها مهم بوده زیرا گیاهان آلوده غیر قابل فروش می شوند .
در اثر آلودگی گیاه به استرین هاي بیماري زاي اگروباکتریوم، سلولها بیش از حد تکثیر میشوند که منجر به تشکیل تومور - گال - طوقه و یا ریشه هاي نابجاي بیش از حد - ریشه مویی - می گردد. گال طوقه همچنین از رشد گیاهان بالغ به دلیل کاهش توسعه سیستم ریشه یا اختلال در جریان آوندي گیاهان جلوگیري می کند. باکتري Agrobacterium یک باکتري خاکزاد بوده و سال هاي زیادي را می تواند به صورت ساپروفیتی در خاك و بقایاي گیاهی باقی بماند.
ایجاد گال توسط این باکتري، به دلیل وجود یک پلاسمید بزرگ به نام در گونه هاي اگروباکتریوم می باشد. در طول فرآیند آلودگی، یک ناحیه از pTi به نام T-DNA از سلول باکتري به ژنوم سلول گیاهی منتقل و متصل شده، و باعث تولید مقدار زیادي هورمون هاي رشد گیاهی - اکسین و سیتوکینین - در محل نفوذ باکتري و بروز گال می شود در حال حاضر این بیماري در بیشتر استان هاي کشور وجود دارد. به دلیل اهمیت و گسترش بیماري در این پژوهش مطالعاتی روي خصوصیات فنوتیپی و تنوع ژنوتیپی آن صورت گرفت.
مواد و روشها
جداسازي و بررسی خصوصیات فنوتیپی و تغذیه اي جدایه ها طی فصول مختلف سال، از باغات مو و گلخانه هاي تولید گل رز و مزارع چغندرقند در مناطق مختلف استان هاي فارس و کهگیلویه و بویر احمد نمونه برداري و گیاهان آلوده به آزمایشگاه منتقل شد. سپس گال ها از گیاهان آلوده جدا، و پس از شستشوي سطحی به مدت چند دقیقه در محلول هیپوکلریت سدیم %10 قرار داده شد و پس از چندبار شستشو، گال ها به قطعات کوچکتر خرد شده و در یک هاون سترون همراه مقداري آب له گردید. جداسازي عامل بیماري روي محیط هاي کشت انجام شد.
جهت بررسی خصوصیات فنوتیپی و تغذیه اي جدایه ها از روش هاي استاندارد باکتري شناسی استفاده شد همچنین از محیط کشت هاي انتخابی شامل و آزمون هاي افتراقی مهم براي تمایز بیووارهاي و استفاده گردید . تشخیص گونه هاي بیماري زاي باکتري با آغازگرهاي اختصاصی و آزمون اثبات بیماري زایی براي تشخیص گونه هاي بیماري زاي باکتري Agrobacterium از آغازگرهاي اختصاصی و طراحی شده بر اساس نواحیاستفاده شد. جهت انجام واکنش PCR، سوسپانسیونی از باکتري با غلظت 108 cfu/mlبه مدت 10 دقیقه جوشانده شده و بلافاصله به مدت یک دقیقه روي یخ قرار گرفت. سپس به مدت چند دقیقه در دور 1100g سانتریفیوژ شده و از فاز رویی مستقیما در PCR استفاده شد.
میزان مواد مورد استفاده از هر یک از آغازگرها، آنزیم پلی مراز و بافر 10× PCR به مقدار 2/5 µL به اضافه 2 µL از سوسپانسیون جوشانده باکتري بود. چرخه حرارتی براي آغازگرهاي A/C´ با واسرشت سازي اولیه در دماي 94 ºC به مدت یک دقیقه آغاز و سپس 40 چرخه شامل واسرشته سازي DNA در دماي 94 ºC به مدت یک دقیقه، اتصال آغازگر در دماي 54 ºC به مدت یک دقیقه، امتداد در دماي 72 ºC به مدت یک دقیقه و در نهایت یک سیکل امتداد نهایی در دماي 72 ºC به مدت پنج انجام شد .
به منظور بررسی قطعات تکثیر شده، ژل آگارز یک درصد تهیه و محصولات PCR به همراه مارکر 1kb - تهیه شده از شرکت در چاهک هاي آن بارگذاري و به مدت یک ساعت با ولتاژ 90 ولت الکتروفورز شد. پس از آن با استفاده از اتیدیوم بروماید رنگ آمیزي صورت گرفت و با استفاده از دستگاه از آن عکسبرداري شد. جهت اطمینان از تشخیص گونه هاي بیماري زا توسط آغازگرهاي اختصاصی، آزمون بیماري زایی بر روي گیاهان مختلف آفتابگردان - ،کالانکوئه و گوجه فرنگی انجام گردید، و به ساقه این گیاهان توسط یک سوزن باریک، از کشت 24 ساعته، باکتري آگروباکتریوم مایه زنی شد.
آزمون
جهت بررسی تنوع ژنتیکی جدایه هاي باکتري براي تکثیر قطعات، بین نواحی حفاظت شده استفاده گردید. بر این اساس از آغازگرهاي و استفاده شد . میزان مواد مورد استفاده از هر یک از آغازگرها، آنزیم Tag DNA پلی مراز و بافر 10×PCR به مقدار 2/5 µL به اضافه 2 µL از سوسپانسیون جوشانده باکتري بود. چرخه اولیه با واسرشت سازي اولیه در دماي 95 ºC به مدت دو دقیقه آغاز و سپس 30 تا 35 چرخه شامل واسرشته سازي DNA در دماي 94 ºC به مدت یک دقیقه و 92 ºC به مدت 30 ثانیه، اتصال آغازگر در دماي 53 ºC به مدت یک دقیقه، امتداد در دماي 72 ºC به مدت یک دقیقه و در نهایت یک سیکل امتداد نهایی در دماي 72 ºC به مدت پنج دقیقه انجام شد .
به منظور بررسی قطعات تکثیر شده در آزمون rep-PCR، ژل آگارز 1/5 درصد تهیه و محصولات PCR به همراه مارکر 1kb - تهیه شده از شرکت در چاهک هاي آن بارگذاري و به مدت 4 ساعت با ولتاژ 100 ولت الکتروفورز شد. پس از آن با استفاده از اتیدیوم بروماید رنگ آمیزي صورت گرفت و با استفاده از دستگاه از آن عکسبرداري شد. سپس وزن مولکولی قطعات تکثیر شده اندازه گیري شد.
آنالیز داده هاي ژنوتیپی
با استفاده از نرم افزار فاصله ژنتیکی جدایه ها رسم گردید .فاصله یا شباهت ژنتیکی بین افراد بر اساس مارکرهاي مولکولی، به صورت وجود یا عدم وجود نوار در ژل تعیین شد. تجزیه خوشه اي بر اساس روش مراتبی انجام و براي بررسی فاصله واقعی میان کلاسترها از روش و ضریب تشابه جاکارد استفاده گردید .مشخصات ژنوتیپی بر اساس ERIC-PCR به صورت کدهاي یک - براي وجود باند - و صفر - براي عدم وجود باند - در این نرم افزار تعریف و بر پایه خصوصیات ژنوتیپی دندروگرام مربوط به 30 جدایه توسط این نرم افزار رسم و درصد تشابه بین جدایه هاي موجود در گروه ها محاسبه گردید.
نتایج وبحث
از گیاهان مو، گل رز و چغندر قند داراي علائم گال طوقه یک باکتري گرم منفی، اکسیداز و کاتالاز مثبت جدا شد، که بر اساس نتایج آزمون هاي بیوشیمیایی و افتراقی همچنین با استفاده از محیط هاي کشت انتخابی شامل 1A و RS، جدایه هاي درختان مو به عنوان و جدایه هاي گیاهان گل رز و چغندرقند به عنوان جدایه - تشخیص داده شد .در بررسی خصوصیات فنوتیپی و تغذیه اي نیز جدایه هاي مختلف همگن نبوده و در تعدادي از آزمون ها با هم اختلاف داشتند. به علاوه اینکه همبستگی خاصی بین تمایز فنوتیپی و محل جمع آوري آن ها وجود نداشت.
در تشخیص گونه هاي بیماري زاي باکتري با آغازگرهاي اختصاصی، تمامی جدایه ها قادر به تکثیر باند 224 جفت بازي با آغازگرهاي اختصاصی A/C شدند، هرچند که در بعضی از جدایه ها، باند هاي غیر اختصاصی نیز مشاهده شد. با توجه به اینکه آغازگرهاي اختصاصی A/C براساس نواحی virD2 موجود در پلاسمید Ti، طراحی شده بودند، تکثیر باند 224 جفت بازي نشان دهنده وجود پلاسمید Ti در این جدایه ها و قابلیت بیماري زایی و ایجاد گال توسط آن ها می باشد.
در آزمون بیماري زایی بر روي گیاهان مختلف نیز، در بعضی موارد، تعدادي از جدایه ها روي هیچ کدام از گیاهان مورد آزمون ایجاد گال نکردند، که شاید مربوط به عدم سازگاري بین بیمارگر و گیاهان استفاده شده در این تحقیق بوده است. در آزمون ERIC-PCR با استفاده از آغازگر ERIC1R/ERIC2 باند هایی در اندازه هاي حدود 300 تا 3500 جفت بازي تکثیر شد در این آزمون تنوع زیادي در بین جدایه ها مشاهده گردید که با تحقیقات صفدري و اپستین و همکاران مطابقت دارد. در آنالیز نقوش حاصل از جفت آغازگر، جدایه هاي به دست
