بخشی از مقاله
چکیده
ژن GHF1، روي کروموزم شماره یک طیور قرار دارد که بر روي صفات رشد و ترکیبات لاشه اثر دارد. DNA ژنومی از نمونه هاي خون 120 قطعه جوجه متعلق به لاین گوشتی آرین استخراج شد. واکنش زنجیره پلی مراز - PCR - جهت تکثیر قطعه 599 جفت بازي از اینترون 5 ژن GHF1 انجام گرفت. بخشی از ژن GHF1 بوسیله روش PCR-RFLP و آنزیم محدوداالاثر Taq1 تعیین ژنوتیپ شد. محصولات هضم شده توسط الکتروفورز بر روي ژل آگارز 2 درصد و رنگ آمیزي با اتیدیوم بروماید تفکیک شدند.
آنالیز دادهها با نرم افزار PopGene32 انجام شد. ژنوتیپهاي AA، AB و BB به ترتیب با فراوانیهاي 60/83، 32/5، 6/67 در این جمعیت تشخیص داده شدند. فراوانیهاي آللی A و B به ترتیب 0/7708 ،0/2292 برآورد گردید. آزمونχ2 و G تعادل هاردي - واینبرگ در جمعیت را نشان دادند با توجه به نقش تنظیم کنندگی این ژن در فعالیتهاي بدن و همچنین بهبود کیفیت لاشه در طیور، به نظر می رسد این ژن می تواند بعنوان مارکر مولکولی براي اصلاح نژاد طیور مورد استفاده قرار گیرد.
مقدمه
یکی از اهداف اصلی اصلاح کنندگان، انتخاب پرندگانی با عملکرد بالا - از نظر سرعت رشد، ضریب تبدیل و تولید گوشت - و سود اقتصادي می باشد. اگرچه انتخاب معمول بر اساس ارزشهاي فنوتیپی براي جوجههاي گوشتی، سبب بهبود ژنتیکی در سرعت رشد و میزان تولید گوشت طی نیم قرن گذشته شده است، با این وجود شدت انتخاب بالا براي این صفات، نقایص فیزیولوژیکی مانند چاقی، آسیت و مشکلات اسکلتی همراه با کاهش ایمنی بدن را موجب شده است
انتخاب به کمک نشانگرهاي مولکولی می تواند جهت افزایش بازده انتخاب و حصول پیشرفت ژنتیکی بیشتر در اصلاح نژاد طیور مورد استفاده قرار گیرد. به طوري که نشانگرهاي ژنتیکی مرتبط با جایگاههاي صفات کمی - - QTL، انتخاب مستقیم بر اساس ژنوتیپ ها را امکان پذیر ساخته است . - 2 - بنابراین به منظور بهبود همزمان در صفات تولیدي و شایستگی، نشانگرهاي مولکولی مرتبط با یک یا هر دو گروه از صفات می تواند مورد استفاده قرار گیرند
ژن GHF1 که با نام فاکتور 1 ژن هورمون رشد معروف است در بسیاري ازموجودات اعم از پرندگان، ماهی، انسان و سایر پستانداران شناسایی شده است - . - 6 این ژن عضوي از خانواده فاکتورهاي نسخه برداري است. این ژن اولین فاکتور رونویسی هیپوفیزي است که براي توسعه تیپ هاي سلولی تیروتروپ، سوماتوتروپ و لاکتوتروپ ضروري می باشد. به این ترتیب که رونویسی از یک سري ژن ها را در سلولهاي اختصاصی فعال و در مدت زمان مشابه از رونویسی نامناسب سایر ژنها جلوگیري می کند.
علاوه بر این به طور مثبت خود تنظیمی مربوط به ژن خودش را هم با اتصال به مکان هایی داخل پروموتور بر عهده دارد. بنابراین این ژن رونویسی از پروموتورهاي GH ، PRL، زیر واحد بتا هورمون تیروئید و pit-1 را فعال می کند - . - 5 جهش در این ژن سبب اختلالاتی در ترشح GH ,PRL و TSH می شود که این موضوع با مطالعه بر روي موش هاي پاکوتاه و همچنین انسان ثابت شده است - . - 3 هدف از مطالعه حاضر، شناسایی چندشکلیهاي تک نوکلئوتیدي - SNP - ژن GHF1 و محاسبه فراوانیهاي ژنی و ژنوتیپی در جمعیت لاین گوشتی آرین می باشد.
مواد و روشها
در این تحقیق تعداد 120 پرنده نر و ماده از خطوط پدري و مادري لاین گوشتی آرین خونگیري به عمل آمد. استخراج DNA از خون کامل به روش میلر و همکاران - 1989 - انجام شد. به منظور تکثیر منطقه اینترون 5 ژن GHF1 از کیت PCR Universal - ژن فن آوران ایران - و یک جفت پرایمر به شرح زیر استفاده گردید.
5´- GGA CCC TCT CTA ACA GCT CTC- 3´
5´- GGG AAG AAT ACA GGG AAA GG- 3´
حجم نهایی واکنش 25 میکرولیترمی باشد. واکنشPCR با برنامه حرارتی زیر به تعداد 35 سیکل در دستگاه ترموسایکلر انجام شد.
پس از آزمایش غلظت هاي مختلف اجزا PCR، شرایط بهینه PCR با حجم نهایی 15 μl به صورت 1x بافر PCR، 2 mM Mgcl2، 0/25 μM آغازگر، dNTPs 200 μM، یک واحد آنزیم Taq پلیمراز و DNA الگو به میزان 150 ng بدست آمد. برنامه حرارتی مناسب براي آغازگر مورد مطالعه به صورت: واسرشته سازي اولیه در 94 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه و 35 سیکل شامل:
واسرشته سازي اولیه در 94 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه، اتصال آغازگرها در دماي 61 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه و مرحله بسط در دماي 72 درجه سانتیگراد به مدت 1 دقیقه انتخاب و بسط نهایی در دماي 72 درجه سانتیگراد به مدت 8 دقیقه در نظر گرفته شد. جهش نقطه اي اتفاق افتاده - C/T - در اینترون 5 ژن GHF1 با آنزیم برشی TaqI مورد شناسائی قرار گرفت. هضم آنزیمی در حجم 15 میکرولیتر و با مصرف 5 واحد آنزیمی تحت شرایط بافري و دماي 37 درجه سانتیگراد انجام گرفت .به این ترتیب قطعات 492، 396و 96 جفت بازي حاصل شد - شکل شماره . - 1 براي مشاهده قطعات هضم شده از ژل آگارز 2 درصد و ولتاژ 150 به مدت 1 ساعت استفاده شد. رنگ آمیزي ژل با اتیدیوم بروماید صورت گرفت و قطعات تکثیر شده زیر لامپ UV مشاهده گردیدند. براي برآورد فراوانی ژنوتیپها،آللها و آزمون کاي اسکور - - χ2 از نرم افزار PopGene32استفاده گردید.
نتایج
کمیت و کیفیت DNA استخراج شده به کمک دستگاه اسپکتروفتومتر مورد بررسی قرار گرفت و مشخص گردید کیفیت نمونه ها مطلوب است. و همانطور که انتظار می رفت قطعه 599 جفت بازي از اینترون 5 ژن GHF1 تکثیر شد. جهت تأیید صحت قطعه حاصله از مارکر M100 استفاده شد.
یک جهش تک نوکلئوتیدي در اینترون پنج ژن GHF1 در موقعیت باز 1459356 ، سبب تبدیل نوکلئوتید C به T شده است و یک جایگاه برش براي آنزیم برشی Taq1 ایجاد کرده است . با هضم آنزیمی قطعه تکثیر شده 599 جفت بازي، قطعات 467 و 132 جفت بازي به عنوان هموزیگوت BB، قطعات 599، 467و132 جفت بازي به عنوان هتروزیگوت AB و قطعه 599 جفت بازي به عنوان هموزیگوت AA تعیین ژنوتیپ شدند.
شکل -1 هضم آنزیمی محصولات PCR
شکل -2 محصولات PCR
جدول -1 فراوانی ژنوتیپی براي محصولات هضم آنزیم Taq1
فراوانی ژنی و ژنوتیپی براي جایگاه مورد نظر با استفاده از نرم افزار PopGene32 محاسبه گردید. فراوانی ژنی و ژنوتیپی محاسبه شده براي جمعیت مورد مطالعه در جدول 1 نشان داده شده است.
در این تحقیق مشخص شد که ژنوتیپ AA بیشترین فراوانی را دارد و ژنوتیپ BB کمترین فراوانی را دارد. فراوانی آللی بترتیب A= 0/77 و B= 0/23 بدست آمد. نتایج این تحقیق نشان می دهد که سه ژنوتیپ در تعادل هاردي واینبرگ قرار دارند
بحث
با وجود آنکه برنامه هاي انتخاب و استفاده از مدل هاي حیوانی همواره توانسته است پیشرفت ژنتیکی قابل ملاحظه اي را در نسل هاي آتی بوجود آورد اما نیاز به روش هائی که منجر به افزایش صحت و دقت انتخاب در ارزیابی هاي ژنتیکی گردد همواره احساس شده است. یکی از راهکارهاي احتمالی مناسب براي دستیابی به اهداف فوق، استفاده از نشانگرهاي ژنتیکی است
دیدگاه ژن هاي کاندید یکی از جدید ترین محورهاي تحقیقاتی براي بهبود صفات تولیدي در طیور می باشد و در دهه اخیر بسیاري از تحقیقات ژنتیک مولکولی را به خود اختصاص داده است که در آن حیوانات بر اساس ژن هاي مؤثر بر صفات، مورد ارزیابی و انتخاب قرار می گیرند
