بخشی از مقاله
سابقه
بیمرانی که به سالک پوستی (CL) از گونه های لشمانیا مبتلا هستند در معرض ریسک ابتلا به سالک پوستی منتشر شونده (DCL) یا مخاطی (ML) قرار دارند. پس از تشکیل یک آسیب پوستی اولیه در محل گزش یک پشه (شن مگس) مبتلا به سالک، این عفونت برای تشکیل آسیب های ثانوی نیز منتشر گردد. این رخ مانه فراگستری باعث مریضی مهمی می شود و اغلب با یک واکنش مصون فرا0التهابی همراه است که منجر به از بین رفتن بافت های بینی و حلق در ML و ظاهر شدن باگره ها یا آسیب های پوستی زخم دار در DCL می گردد. اخیراً ما این رخ مانه تهاجمی را به وجود ویروس RNA سالک (LRV) در آسیب های L. guyanensis مرتبط ساختیم که نشان میدهد که LRV مسئول پاراسیتامیای گسترش یافته، فرا-التهابی مخرب و تشدید کلی بیماری می باشد. مطالعات بیشتری در مورد این روابط و توزیع LRV در آسیب های لشیمانیای دیگر از منفعت روشهای بهتر شناسایی ویروسی و چندی سنجی، و خصوصاً روشهایی که به دانش قبلی در مورد توالی ویروسی وابسته نیستند، برخوردار خواهد بود، وقتی که LRV ها تکامل مهمی از واگرائی را نشان میدهند.
روش شناسی/یافته های اصولی
این مطالعه تکنیک های مختلفی را گزارش میدهد، که از بین آنها، استفاده از یک پادتن تک تاگی ضد-dsRNA بخاطر تشخیص کمی و خاص خود از dsRNA(J2)به یک شیوه مستقل از توالی ظاهر می گردد. کاربردهای J2شامل شارندگی ایمنی، ELISA و لکه های نقطه ای است: تکنیک هایی که مکمل مجموعه ابزار شناسایی دیگر مانند خالص سازی اسید نوکلئیک و PCR فوری و کمی هستند. و همه روشها را ارزیابی می کنیم و همچنین شناسایی LRV موفقیت آمیز را توسط پادتن J2 در چندین آسیب انگلی اثبات میکنیم، که نمونه مجزایی از بیماران و بافت برداری آسیبی موش های آلوده است.
نتیجه گیری / اهمیت
ما پیشنهاد میکنیم که تهذیب این روشها را میتوان بعنوان یک ابزار شناختی در شناسایی وجود LRV بکار برد و بصورت بالقوه ریسک مربوط به LRV از عواقب آنرا در سالک پوستی ارزیابی کرد.
مطالبی در مورد مؤلف
اندوسیمبوسیس ویروس ها در میکروب ها یک رابطه محیطی متداول و مشخص است که ویروس ها انگیزه های تناسب در تبادل را برای استفاده سیستم سوخت و سازی به میزبان سلولی خود میدهند. ما بتازگی این را بعنوان یک عامل مهم در سالک های فراگستری خاصی در جنوب آمریکا بیان کرده ایم، که اسید نوکلئیک یک ویروس در انگل های لشمانیا بصورت یک پادگن درونی قوی عمل میکند که باعث واکنش التهابی مخربی می شود، که بیماری را تشدید می کند. ویرویس لشمانیا RNA (LRV) در جنبه های بسیاری از لشمانیا بعنوان یک عفونت ثابت وجود دارد؛ این آسیب های مثبت LRV در سراسر آمریکای جنوبی در سالک پوستی یافت می شود که اغلب توسط رخداد فراگستری های عفونتی با یک واکنش فرا-التهابی زیرین پیچیده می گردد. ما در این گزارش استفاده از پادتن تک تاگی ضد-dsRNA را توصیف میکنیم (J2) که dsRNA را به شیوه کمی و وابسته به توالی شناسایی میکند. نسخه های پالوده این روشها را میتوان بعنوان ابزار تشخیصی برای شناسایی وجود LRV و ارزیابی ریسک مربوط به LRV سالک های پوستی، به میدان انتقال داد.
مقدمه
سالک یکی از مهمترین بیماری های انگلی تک یاخته ای انسانی در سراسر جهان است، و 12 میلیون نفر به آن مبتلا هستند و 350 میلیون نفر نیز در 98 کشور دنیا در معرض ابتلا به آن قرار دارند. این بیماری عمدتاً به دو شکل بالینی اصلی ظاهر می گردد: 1) سالک پوستی (CL) که در آن، آسیب ها عمدتاً موضعی یا خود شفا هستند، یا 2) سالک احشایی (VL) که بصورت مرگباری به احشاء منتشر می گردد. CLممکن است توسط گونه های مختلفی، از گروه فرعی لشمانیا، یا اعضای گروه فرعی L. (Viannia) ایجاد گردد، درحالیکه VL اغلب به L. donovani, L. infantum و L. chagasi نسبت داده می شود. فراتر از عوامل انگلی درونی، عوامل برونی در میزبان نیز طیف نشانه های بیماری سالک را تغییر میدهند.
در آمریکای جنوبی، بیماران CL آلوده شده توسط L. braziliensis, L. panamensis و L. guyanensis برای توسعه سالک پوستی منتشر شونده و یا مخاطی، در معرض ریسک قرار دارند، که عوارضی از CL هستند که نیازمند انتشار انگل ها از آسیب های اولیه به محل های ثانویه است و سبب آسیب هایی می گردد که اغلب با واکنش التهابی مخربی همراه هستند. بیماری مخاطی بخاطر واکنش ضعیف خود نسبت به درمان های متداول (مانند انتیمون) مشهور است و اغلب توسط باکتری های ثانویه یا عفونت های قارچی پیچیده می گردد. اطلاعات کمی در مورد بیماری زایی سالک سوخت و سازی و مخاطی (خصوصاً منبع واکنش التهابی کنترل نشده مشاهده شده در بعضی از بیماران) وجود دارد. دو عاملی که با بیماری مخاطی و منتشر شونده همراه هستند شامل چند ریختی ژنتیکی میزبان و آلودگی همزمان HIV می باشد.
ما اخیراً پیشنهاد کرده ایم که وجود ویروس dsRNA انگلی می تواند به شدت بیماری در آسیب های L. guyanensis کمک کند. این ویروس dsRNA لشمانیا در بسیاری از گونه های L. (Viannia) و همچنین در یک آسیب L. major یافت شده است. همچنین در مدلهای خانواده موش های عفونت L. guyanensis ، ژنوم dsRNALRV توسط گیرنده شبیه به ناقوس (TLR3) شناسایی می گردد که بیماری را بصورت وابسته به دوز تشدید می کند.
لشمانیا یک دوره زندگی دوزایی، با شکل پروماستیگوت خارج سلولی جنبنده در میان روده پشه شن مگس و شکل آماستیگوت میان سلولی غیر جنبنده در درشت خوار میزبان پستانداران دارد. مدل ما پیشنهاد میکند که شناسایی درونی LRV در چند ساعت اول عفونت رخ میدهد. در اینجا قسمتی از انگل ها می میرند، و dsRNA ویروسی آزاد می کنند که سپس به TLR3 می چسبد و آبشار التهابی IFN-نوع 1 را آزاد می سازد که بیماری را تشدید می کند. بنابراین بار LRV بالایی در انگل های عفونتی میتواند یک عامل تعیین کننده اصلی شدت بیماری و بیماری زایی باشد.
LRV عضوی از خانواده Totiviridae است که ویروس های یافته شده در چندین قلمرو از زندگی، را دوباره گروه بندی می کند که شامل انگل های تک یاخته مانند Giardia, Trichomonas vaginalis، و قارچ هایی مانند Helminthosporium sp. و S. cerevisiae و همچنین پشه و ماهی آزاد می باشد. آنها ویشه های کوچک و ساده ای هستند که حاوی یک ژنوم dsRNA هستند که پروتئین کاپسید منفرد خود و یک بسپارگر RNA وابسته به RNA را کدگذاری میکند، که برای تکثیر dsRNA ژنومی ویروسی و نسخه برداری ssRNA ویروسی ضروری است. نسخه های ویروسی در سیتوپلاسم سلول به پروتئین کاسپید تبدیل می شود و در بیشتر Totiviridae ها نیز به پلی پپتید RdRp-کاپسید تبدیل می شود. مطابق مطالعات کامل در مورد مخمر، یک ویشه منفرد از بیش از 100 ملکول پروتئین کاپسید و یک یا دو واحد فرعی RdRp-کاپسید در اطراف ملکول dsRNA ژنومی منفرد تشکیل شده است. LRV ها شناسایی شدند و چندین سال قبل در L. (Viannia) braziliensis و guyanensis و همچنین L. major توصیف شدند. اگرچه سازمان ژنومی آنها با هم مشابه است، اما تنوع بالا در توالی نوکلئوتید بین LRV های L. (Viannia) و L. major ویروس های لشمانیا را به گروه های LRV1 و LRV2 تقسیم بندی کرده است.
یک یافته مهم از مطالعه اصلی ما اینست که فقط انگل های دارای سطوح بالایی از LRV شدت بیماری را تشدید می کنند و مطالعات قبلی نشان داده اند که تنوع قابل ملاحظه ای در توالی در بین LRV ها یافت شده است. بنابراین مطالعات در مورد نقش LRV تا حد زیادی توسط دسترس پذیری روشهای متنوع برای شناسایی و تعیین کمیت LRV یاری می شوند. تا اینجا، ما از آسیب های انگلی استفاده کرده ایم که دارای سطوح مختلفی از LRV بعنوان یک استاندارد هستند. تعیین کمیت و شناسایی قابل اطمینان توسط استخراج dsRNA ، PCR کمی و فوری، و همچنین شناسایی ایمن ژنوم LRV در نمونه های کافته شده، ثابت یا انگل های زندهانجام شد. اگرچه qRT-PCR را میتوان بصورت مؤثر استفاده کرد و یک روش قوی برای مطالعات ملکولی کامل در مورد آسیب های مرجع است، با اینحال ممکن است بعلت نوکلئوتید ها و چند ریختی های اسید آمینه ممکن LRV ها، کاربرد محدودی برای نمایش LRV در انگل های مشخص نشده از میدان داشته باشد. این مسئله توسط تمرکز بر شناسایی dsRNA از طریق استفاده از یک پادتن تک یاخته ای ضد-dsRNA برطرف شد، که dsRNA های مستقل از توالی نوکلئوتید اساسی آنرا شناسایی میکند. ما این روش را برای چندین قسمت مجزای انسانی بر روی نمونه L. braziliensis بدست آمده از یک بیمار و همچنین بر روی بافت برداری آسیب های خانواده موش ها اعمال کردیم که راحتی نسبی استفاده از این روش ها برای کاربرد میدانی را نشان میدهد. ما پیشنهاد میکنیم که این تکنیک پتانسیل تشخیصی بالایی برای پیش بینی ریسک مربوط به LRV از انتشار سالک دارد.
روشها
بیانیه اخلاقی
این مطالعه توسط هیئت اخلاقی Canton of Vaud سوئیس برای تحلیل انگل های لشمانیای مجزا شده از بیماران تأیید شد. دو آسیب انگلی L. braziliensis از بیماران آلوده L. braziliensis جدا شدند که توافقنامه پذیرش استفاده از مواد برای انتشار را امضا کرده بودند. آسیب های انگلی لشمانیای دیگر مورد استفاده در این مطالعه، خطوط معمول جدا شده چند سال پیش هستند که در چندین گزارش توصیف شده اند.
کشت و آسیب های انگلی
آسیب های مرجع L. guyanensis مختلف محتوای شناخته شده LRV مورد استفاده قرار گرفت: 1) دو بافتزاد گرفته شده از جمعیت M4147 آلوده شده توسط LRV انتخاب شده، 2) قسمت های مجزای انسانی L. guyanensis ، Lg 1398 و Lg 1881 و 3) انگل های M5313 L. guyanensis و بافتزادهای غیر سوخت و سازی یا فراگستری. پنج قسمت مجزای انسانی L. braziliensis نیز تحلیل شدند: ، و . دو آسیب از انگل های L. braziliensis از یک بیمار آلوده جدا شد که سالک را منقبض می ساخت: و .
انگل ها بصورت پروماستیگوت در 26 درجه سانتیگراد در محیط حشره اشنایدر آماده شده همراه با 10 درصد سرم گاوی غیر فعال شده گرمایی، ، پنی سیلین/استرتومیسین، بیوپترین و همین کشت شدند.
استخراج dsRNA ویروسی از اسیدهای نوکلئیک کلی
پروماستیپوت های لشمانیای فاز ساکن بمدت 20 دقیقه در RT با 0.4 درصد بازدارنده های سارکوسیل و پرتئیاز رقیق شده در کافته شدند. حاصل تجزیه سلولی سپس در 37 درجه سانتیگراد ابتدا بمدت 30 دقیقه با پروتئیناز K، و سپس بمدت 2 ساعت با پرورانده شد. اسیدهای نوکلئیک از این لیسات ها استخراج شدند، که با 0.3 M استات-سدیم در 70 درصد اتانول تسریع شد، و سپس شسته شد و در آب قرار داده شد. DNA توسط طیف نورسنجی تعیین شد. dsRNA ویروسی خالص پس از هضم مطابق با دستورالعمل های تولید کننده بدست آمد. اسیدهای نوکلئیک در ژل های آگاروس 0.6 تا 1.2 درصد تحلیل شدند که حاوی برای آسیب اسید نوکلئیک بودند.
PCR فوری و کمی (qRT-PCR)
RNA از پروماستیگوت های فاز ساکن با استفاده از تریزول و مطابق با دستورالعمل های تولید کننده استخراج شد.
پس از استخراج، مشارکت و شستشو، RNA در آب قرار داده شد و توسط طیف نور سنجی تعیین کمیت شد. سپس از RNA برای ترکیب cDNA با بکار برده شد، که در نهایت توسط جعبه پالایش QIAquickPCR پالایش شد. در راه حل واکنشی 0.5 از چاشنی رقیق شده در قرار داده شد. این واکنش از تقلیب اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد برمدت 5 دقیقه و 40 دوره از تقویت تشکیل شده بود: 10 ثانیه در 95 درجه، 10 ثانیه در 60 درجه، و 10 ثانیه در 72 درجه سانتیگراد و مرحله شناسایی فلورسانس در 78 درجه سانتیگراد برای تعیین کمیت DNA تقویت شده پس از هر دوره. اولیگو نوکلئوتیدهای روبرو مورد استفاده قرار گرفتند: و و . سری A و سریB بر مبنای توالی ژنوم و ژن بودند. سطوح نسخه برداری LRV در سه نسخه ای نسبی برای ژن تعیین کمیت شد. تحلیل و بدست آوردن داده ها با نرم افزار و روش انجام می شد.
آسیب ایمنی و حفاظت پادتن ضد-کاپسید
کاپسید LRV از آماده سازی cDNA از ساده سازی شد و در نسخه برداری شد. توالی آن تا حد زیادی با توالی کاپسید مشابه بود. کاپسید باز ترکیب پالایش شد و سپس برای ایمن سازی خرگوش ها بکار برده شد. پروتئین از عصاره های انگلی کامل توسط تعیین کمیت شدند و بارگذاری شد و در 10 درصد ژل پلی اکریلامید جداسازی شد، سپس به غشاء نیتروسلولوز انتقال داده شد. پس از 1 ساعت از مرحله انسداد در 5 درصد شیر رقیق شده در ، غشاء در طی شب در دمای 4 درجه سانتیگراد با پادتن پلی کونال ضد-کاپسید پرورانده شد. پس از 4 بار شستشوی 15 دقیقه ای در RT، غشاء بمدت 1 ساعت با پادتن ضد-خرگوش همراه با پروکسیداز پرورانده شد و سپس 4 بار شسته شد و توسط نورتابی شیمیایی ECL آشکارسازی شد.
آرایه های پپتید بر روی غشاء سلولز و نقشه برداری اپیتوپ
برای نمایش اپیتوپ پادتن، 74 پپتید هم پوشانی 20-mer که توالی را می پوشانند ترکیب شدند و با پروتئین و تسهیلات شیمی پپتید، به غشاء سلولز پیوست شدند.
پپتیدها با استفاده از ترکیب کننده باهم ترکیب شدند. غشاء سلولز استفاده شده یک صفحه بود. ارتباط دهنده پپتید غشاء در دامنه وسیعی از pH آبی در دمای محیط بمدت 12 ساعت ثابت بود. فضاگیر از 8 تا 10 واحد الکل دهنی اتیلن تشکیل شده بود و گروه های اسیدهای پایانی را برای آغاز ترکیب پپتید داشت. فضاگیر در با قطر نقطه معمول 4 میلیمتر و میانگین بارگیری شد. پپتیدها توسط ترکیب فاز جامد پلکانی ترکیب شدند. اسیدهای آمینه که گروه های محافظ را داشتند توسط ربات لکه دار شدند. محلول های اسید آمینه با استفاده از شیمی فعال شدند. برای هر دوره، محلول هایی از 20 اسید آمینه معمول در امتداد محلول های اسیدهای آمینه اصلاح شده مورد نیاز توزیع شدند. پس از اضافه سازی اولین اسید آمینه ها، غشاها برای لکه ها برای توالی بعدی آماده شدند. اینکار توسط حذف گروه حفاظتی ترمینال-N توسط پیپیریدین انجام شد. این دوره تکرار شد تا اینکه پپتیدها به طول مورد نظر رسیدند. سپس آرایه ها با اسید تری فلورواستیک درمان شدند تا زنجیره های طرف محلی ظاهر گردد. آرایه ها قبل از استفاده در دمای نگهداری شدند. مانند غشاهای نیتروسلولز کلاسیک، این غشاهای پپتید با پادتن پلی کونال ضد-کاپسید پرورانده شدند تا امکان تعیین اپی توپ ها ایجاد شود.
توالی LRV
ژنوم تا حدودی دارای این توالی بود: اول dsRNA های ویروسی از تقریباً پروماستیگوت فاز ساکن پس از استخراج کامل اسیدهای نوکلئیک و هشم از DNA ژنومی و پالایش پس از 0.8 درصد الکتروفورز ژل آگاروس با استفاده از ژل Wizard SV و سیستم تمیز کننده PCR بدست آمدند. سپس ویروسی مانند بالا ترکیب شد و از برای تقویت PCRبا پلیمراز در بافر خود استفاده شد که با ، . از هر oligonucleotide تقویت می شد. واکنش های PCR از 35 دوره تشکیل شده بود: 1 دقیقه در PCR، 1 دقیقه در و 2 دقیقه در . دو قسمت PCR با oligonucleotide های روبرو ایجاد و توالی سازی شدند: 1) و ، و 2) و . این دو فرآورده به ما این امکان را میدهد تا از 1398 توالی ژنوم LRV را بدست آوریم که شامل قالب قرائت باز کامل کاپسید ویروسی می باشد .
ریزبینی شارندگی ایمنی (IFM)
دو پروتکل متفاوت مورد استفاده قرار گرفت. در پروتکل A، پروماستیگوت های فاز ساکن با 4 درصد فرمالدئید در PBS بمدت 20 تا 30 دقیقه ثابت شدند، شسته شدند و در قرار داده شدند و سپس بمدت 30 دقیقه در RT به اسلاید های پوشیده شده متصل شدند. پس از مرحله permeabilization 10 دقیقه ای در ، سلول ها بمدت 45 تا 60 دقیقه در 2 درصد آلبومین سرم گاوی در قرار داده شدند و در در طی شب با پادتن پلی کلونال ضد-کاپسید خرگوش یا پادتن موش در 1 درصد در پرورنده شدند. سپس سلول ها 4 بار در PBS شسته شدند و بمدت 1 ساعت با ضد خرگوش از بز همراه با یا پادتن ضد موش از بز همراه با در 1 درصد BSA در پرورانده شدند. اینها دو بار شسته شدند، بمدت 10 تا 30 دقیقه با پرورانده شدند، دوباره شسته شدند و در نهایت با Vectashield دقیقه شده 100 برابر در محلول DABCO یا با استفاده از Permafluorآماده شدند. نمایش فلورسانس با میکروسکوپ در تسهیلات تصویربرداری سلولی انجام شد.
در پروتکل B، انگل با 2 درصد در بمدت 2 دقیقه ثابت شدند. سلول ها یکبار در شسته شدند. سلول در بافر انسداد بمدت 35 دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند و سپس با پادتن موش بمدت 1 ساعت پرورانده شدند.سپس سلول ها 3 بار در PBS شسته شدند و با ضد موش از بز بمدت 1 ساعت پرورانده شدند. پس از یکبار دیگر شستشو در PBS، کاوسلیپ ها در آب شسته شدند و با استفاده از آماده شدند. ریزبینی با استفاده از میکروسکوپ انجام شد و تصاویر با استفاده از نرم افزار بدست آمدند. تحلیل تصاویر با استفاده از انجام شد.
لکه شکاف
انگل در غلظت نهایی در PBS قرار داده شدند. با استفاده از سیستم به غشاهای میکروسلولز چسبیده شد. غشاء در2 درصد شیر غیر چرب بمدت 1 ساعت و سپس با پادتن موش و ضد هیستون از خرگوش در 2 درصد شیر به اضافه 0.2 درصد بمدت 1 ساعت پرورانده شد. غشاء در شسته شد و در ضد موش از بز و ضد خرگوش از بز بمدت 1 ساعت پرورانده شد. غشاء سه بار در و یکبار نیز در شسته شد. تحلیل با استفاده از سیستم عکسبرداری مادون قرمز و نرم افزار انجام شد. نقطه برش بصورت 3 انحراف استاندارد بالاتر از میانگین جذب کنترل منفی LRV محاسبه شد.
ELISA
پروماستیگوت های فاز ساکن در کافته شدند. از کل پروتئین، به 96 صفحه چسبیده شد، که با پلی لیزین در طی شب در 4 درجه سانتیگراد پوشش داده شده بودند. پس از 4 بار شستشو در ، لیزات ها در محلول رقیق معیار بمدت 2 ساعت در RT قرار داده شدند، و بار دیگر در شسته شدند و بمدت 1 ساعت در با پادتن مونوکلونال اولیه موش پرورانده شدند. پس از 4 مرحله شستشوی دیگر، پادتن دو گانه ضد موش ثانویه بمدت 1 ساعت در اضافه شد. سپس دیواره ها شسته شدند و dsRNAرا می توان سپس توسط اضافه سازی OPD در بافر سیترات فسفات تعیین کمیت کرد. واکنش توسط اسیدی کردن با متوقف شد و در با طیف نور سنج اندازه گیری شد. نقطه برش بصورت 3 انحراف استاندارد بالاتر از میانگین جذب کنترل منفی LRV محاسبه شد.
لکه نقطه ای
پلت های پروماستیگوت فاز ساکن در قرار داده شدند و مقدار کمی از آن برای کمیت پذیر کردن BCA در کافته شد. سپس نمونه های انگلی در با پروتئین کلی تنظیم شدند و در غشاء نیتروسلولز با استفاده از دامنه 0.5 تا از پروتئین در هر نقطه نشان داده شدند. برای آزمایش حساسیت این روش، انگل های زنده شمارش شدند، و بصورت ردیفی بین دامنه ای از 10 تا 1000 انگل رقیق شدند و مستقیماً در غشاء نیتروسلولز نشان داده شدند. سپس غشاها قبل از آشکارسازی توسط شناسایی ایمن با استفاده از یک پادتن اولیه و پادتن ثانویه دوگانه ضد موش خشک شدند.
آلودگی موش و استخراج RNA از آسیب های سالک
یک میلیون فاز ساکن با پروماستیگوت در مبنای پای موش های تزریق شدند. آسیب ها در نقطه اوج عفونت مجزا شدند و با هاون در PBS همگن سازی شدند. پس از مرحله گریز از مرکز اولیه برای حذف باقیمانده های بزرگ، شناور سلول دوباره تحت نیروی گریز از مرکز قرار داده شد و پلت برای استخراج RNA کلی، مستقیماً در تریزول قرار داده شد. تقریباً از RNA از هر آسیب بدست آمد و برای تحلیل لکه نقطه ای با پادتن J2 در آب رقیق سازی شد.
نتایج
برای توصیف وجود و بار LRV در آسیب های انگلی L. (Viannia) از طریق روشهای مختلف، ما ابتدا چهار قسمت مجزای انگلی از محتوای LRV متغیر را آزمایش کردیم. دو بافتزاد گرفته شده از آسیب مورد استفاده قرار داده شد: که بار بالایی از LRV و دارد، که در آن، LRV توسط ازمایشان غیر قابل شناسایی است. ما همچنین دو قسمت مجزای انسانی از L. guyanensis را آزمایش کردیم: گرفته شده از آسیب فراگستری از بیماران، که در آن، LRV در سطح خیلی پایینی وجود دارد. برای مقایسه بهتر انواع تکنیک های شناسایی LRV ، هر کدام از آنها از موادی از آماده سازی یک نمونه منفرد انجام شدند. داده های نشان داده شده نشاندهنده روند جمع آوری شده از چندین آزمایش مستقل است.
شناسایی LRV توسط PCR فوری و کمی و الکتروفورز ژل
محتوای LRV بعنوان یک نقطه آغاز با استفاده از روشهای استفاده شده قبلی برآورد شد. در ابتدا اسیدهای نوکلئیک کلی از کشت های پروماستیگوت استخراج شدند و توسط الکتروفورز ژل آگاروس تحلیل شدند. در اینجا یک باند مطابق با اندازه ژنوم dsRNA ویروسی در عصاره های و قابل شناسایی بود، که در مورد دوم ضعیف تر بود. این باند بصورت واضح تری قابل مشاهده بود وقتی که DNA ژنومی انگلی توسط درمان DNASE حذف شد. همانطور که پیش بینی می شود، dsRNALRV در یا در قابل شناسایی نبود. با استفاده از یک رقیق سازی ردیفی اسیدهای نوکلئیک از انگل های آلوده شده توسط LRV ، ما برآورد کردیم که مقدار dsRNALRV در تقریباً سه تا چهار برابر بیشتر از بود.
شناسایی LRV در عصاره های اسید نوکلئیک
ما سپس سطوح نسخه برداری LRV را با استفاده از دو سری استر مختلف تعیین کردیم که قبلاً بصورت موفقیت آمیز برای شناسایی LRV در Lg M4147 و Lg M5313 و مشتق های کلونی آنها استفاده کرده بودیم: سری A، که یک قسمت 124 نوکلئوتید را بر روی RNA ویروسیتقویت می کرد، و سری B، که یک قسمت 103 نوکلئوتیدی را در قالب RdRp تقویت می کرد. RT-PCR کمی انجام شد و برای تقویت بدست آمده از ژن مدیریت kmp11 و سیگنال بدست آمده از بهنجار شد. با استرهای سریA ، تقریباً نصف نسخه برداری LRV را در مقایسه با نشان داد، درحالیکه خط و 1881 هی فرآورده LRV قابل شناسایی را نشان ندارد. همچنین هیچ محصولی با استرهای سری B از بدست نیامد، علیرغم اینکه سطوح بالایی از LRV داشتند. داده های توالی سازی مقدماتی از قالب این نتیجه منفی را توضیح میدهد، و مسئله بالقوه راهکار PCR-مبنا را برای نمایش LRV در انگل های توصیف نشده توضیح میدهد.
شناسایی LRV توسط یک پادتن مختص به کاپسید
شناسایی LRV را میتوان توسط شناسایی پروتئین های ویروسی نیز انجام داد. یک پادتن پلی کلونال خرگوش با میل ترکیبی زیاد برای پلی پپتیدهای کاپسید افزایش داده شد و سپس در آسیب های کنترل توسط لکه دار کردن ایمنی و ریزبینی فلورسانس آزمایش شد. در هر دوی این تکنیک ها، شناسایی LRV در و همچنین انجام شد، که نشاندهنده آسیب قوی در سراسر پروماستیگوت های سیتوسل ها بود. همانطور که پیش بینی می شود، هیچ لکه ای در ، و و حتی در قسمت های مجزای انسانی آلوده به LRV ، قابل مشاهده نبود، که احتمالاً بعلت تنوع توالی LRVاست. توالی های انجام می شد و ماهیت بالایی از کاپسید آنرا در مقایسه با در سراسر قالب باز نشان داد. نقشه برداری اپی توپ ها با استفاده از آرایه های پپتید 20-mer نشاندهنده توالی کاپسید کامل نشان داد که ، توالی کاپسید ترمینال-C را تشخیص می دهد که بصورت ضعیف در نگهداری می گردد و بنابراین توضیح میدهد که چرا توسط در این آسیب تشخیص داده نمیشود.
شناسایی ایمنی LRV توسط یک پادتن مختص به dsRNA
پادتن موش مونوکلونال J2 برای dsRNA امکان شناسایی ویروس های مختلف dsRNA را بصورت مستقل از توالی های آنها فراهم می سازد. برای اندازه گیری کاربرد آن برای شناسایی LRV ، ابتدا بر روی انگل های کنترل توسط ریز بینی فلورسنت با استفاده از دو پروتکل ثابت سازی مختلف آزمایش شد. برای هر دو پروتکل، الگوی آسیب با پادتن J2 مشابه با الگوی پادتن ضد-کاپسید بود. جالب اینکه، سیگنالی با آسیب بدست آمد که نشان میدهد که پادتن ضد-dsRNA توسط تفاوت در توالی در بین LRV ها محدود نمی شد.
از تصاویر بدست آمده از طریق پروتکل دوم، هیستوگرام هایی ایجاد شدند تا توزیع شدت سیگنال بین سلول های منفرد را نشان دهند. یک نقطه اوج مجزا در خط مشاهده شد که کاملاً از کنترل ها یا خط جدا بود. انتشار نقطه اوج تا حدودی گسترده تر از مقداری بود که برای یک جمعیت همگن پیش بینی می گردد که نشاندعنده ناهمگنی در سطوح LRV است. بعضی از نتایج با ضد سرم ضد-کاپسید بدست آمده اند.
ما همچنین استفاده از تکنیک لکه شکاف را نیز برای برآورد بار LRV آزمایش کردیم. در این پروتکل، سلول ها در غشاهای نیتروسلولز مشاهده شدند و با J2 واکنش نشان دادند تا dsRNA و H2A ضد هیستون را برای کنترل تعداد انگل ها شناسایی کنند. تفاوت های واضحی در انگل های و مشاهده شد. هم سلول های ساکن و هم سلول های لگاریتمی آزمایش شدند و نشان داده شد که شدت سیگنال dsRNA تا حد زیادی کشت انگل را تغییر نمی دهد.
شناسایی LRV با استفاده از لکه های شکاف و پادتن J2
نتایج بدست آمده در IFM یا لکه شکاف ما را ترغیب کرد تا پروتکل های سریع تر و ساده تری را برای استفاده پادتن ضد-dsRNAJ2 بررسی کنیم که ممکن است برای نمایش قسمت های مجزای میدانی مناسب باشد، که واگرائی توالی در بین LRV ها پیش بینی می گردد. بنابراین به تکنیک های شناسایی ایمنی دیگر از ELISA و لکه نقطه ای انتقال داده شد. روش ELISAJ2 از لیزات انگلی ابتدایی استفاده می کرد؛ و امکان چندی سنجی نسبی LRV و این تأیید را فراهم می ساخت که در تقریباً چهار برابر فراوان تر از بود. البته محدودیت واضحی از این راهکار، شرایط مورد نیاز برای بار LRV بالا است، که در اینجا با سیگنال نسبتاً پایینی با آسیب در مقایسه با آسیب های منفی/پایین-LRV نشان داده شده است.
شناسایی LRV در لازیت انگلی کلی با استفاده از پادتن J2
آزمایشات لکه نقطه ای با کل انگل های زنده مشاهده شده بصورت مستقیم با انگل های زنده مشاهده شده بر روی غشاهای قابل اطمینانانجام شدند. تمایز بین پروماستیگوت های آلوده و غیر آلوده قابل اطمینان بود و امکان تعیی کمیت نسبی را فراهم می ساخت که تفاوت در بار LRV بیت و را ایجاد می کرد. لکه نقطه ای علاوه بر اینکه یک تکنیک ساده مستقل از توالی LRV است، دارای مزیت نیازمند فقط تعداد کمی از انگل ها است. در اینجا LRV را میتوان در کمتر از 100 انگل از خط شناسایی کرد.
نمایش برای عفونت LRV در قسمت های مجزای انسانی
ما برای ارزیابی کاربردپذیری لکه نقطه ای ضد-dsRNA خود بر روی قسمت های مجزای میدانی، از آن برای نمایش LRV در قسمت های مجزایی انسان استفاده کردیم که قبلاً بصورت مثبت شناخته شده اند. پنج آسیب نشان داده شد. ما قادر بودیم که وجود LRV را در این قسمت های مجزا تأیید کنیم. این مطالعه نشان میدهد که روش لکه نقطه ای با استفاده از J2 یک راهکار معتبر است که میتوان آنرا به قسمت های مجزای لشمانیا از بافت برداری انسانی گسترش داد.
نمایش وجود LRV در L. braziliensis مجزا شده از یک بیمار مبتلا
برای اثبات اینکه راهکار شناسایی ایمن ضد-dsRNA ما می تواند یک ابزار تشخیصی مربوطه در محیط بالینی باشد، آنرا در انگل های مجزا شده سالک آزمایش کردیم که از یک بیمار مبتلا به L. braziliensis بدست آمده بود. این بیمار در بولیوی به این بیماری مبتلا شده بود. دو نمونه انگلی گرفته شدند: Lb 2169 و Lb 2192. انگل ها از این بافت برداری ها کشت شدند و مستقیماً برای وجود LRV توسط لکه نقطه ای با استفاده از پادتن شد-dsRNA آزمایش شدند. انگل های و بترتیب بعنوان کنترل های مثبت و منفی استفاده شدند. یک سیگنال واضح در هر دو قسمت مجزای انگلی از این بیمار مشاهده شد. برای اطمینان از اینکه این سیگنال مثبت بعلت وجود LRV است، نمونه ها دوباره با استفاده از بعضی از تکنیک های شناسایی LRV دیگر آزمایش شدند. توالی این LRV شناسایی شده جدید در حال حاضر انجام می شود. چون وجود LRV می توان یک عامل تشدید کننده در توسعه بیماری سوخت و سازی باشد، تشخیص اولیه محتوای LRV می تواند بعنوان راهنماری برای استراتژی های درمان بکار رود. این آزمایش راحتی و دقت شناسایی dsRNA را اثبات کرد و کاربردپذیری وسیع پادتن ضد-dsRNA را در شناسایی LRV در بین گونه های لشمانیا تقویت کرد.
نمایش LRV در آسیب های پهنه پا
اگرچه این نتایج نشان میدهند که پادتن J2 ما ممکن است پتانسیل این را داشته باشد که LRV را برای کاربرد بالینی شناسایی کند، با اینحال یک محدودیت اصلی می تواند نیاز به مجزاسازی انگل از آسیب های بافت برداری باشد، که همیشه انجام آن در میدان کار آسانی نیست. بنابراین مهم است که کاربردپذیری مستقیم آنرا از آسیب ها آزمایش کنیم و بنابراین از کشت انگل جلوگیری کنیم. یک مطالعه اثبات مفهومی در مورد آسیب های لشمانیا خانواده موش ها انجام شد. پس از استخراج ساده RNA با تریزول از آسیب های لشمانیا از موش های مبتلا به یا ، ما وجود LRV را نیز آزمایش کردیم. LRV فقط در عصاره های آسیب از شناسایی شد. مهم اینکه، این فقط از عصاره کلی RNA مشاهده شد که با اندازه بافت برداری دقیقه ای بالینی مطابقت دارد. این نتیجه نشان داد که ما نه تنها می توانیم LRV را در promastigote شناسایی کنیم بلکه در لیزات های آسیب نیز می توانیم آنرا شناسایی کنیم، که اثبات میکند که این روش شناسایی قابل کاربرد در میدان نیز می باشد.
