بخشی از مقاله
چکیده
افزایش قندخون پس از صرف غذا برای افراد دیابتی یک مشکل جدی میباشد که یکی از راههای مقابله با این مشکل، مهار آنزیم آلفا-گلوکوزیداز بوده است. هدف از این تحقیق، تعیین میزان خاصیت مهارکنندگی آنزیم آلفاگلوکوزیداز توسط عصارهی متانولی اندامهای هوایی تفکیک شدهی گیاهان گل استکانی و سیلن حبابی به روش اسپکتروفتومتری بود. مطابق نتایج مطالعات پارامترهای سینتیکی مهار آنزیم، الگوی مهاربرای عصاره گلِ گیاه گلاستکانیبرگهدار از نوع مهار مختلط و برای گل گیاه سیلنحبابی از نوع مهار غیررقابتی بود. مطابق نتایج این مطالعه فعالیت مهاری گلاستکانیبرگهدار و سیلنحبابی دراندامهای گل و برگ متمرکز است.
مقدمه و هدف
دیابت یک اختلال متایولیکی مختلط است که در اثر نقص ارثی یا اکتسابی در ترشح انسولین یا کاهش پاسخ دهی اندامها نسبت به انسولینِ ترشح شده ایجاد میشود
چنین نقصی باعث افزایش سطح گلوکز خون میشود و این وضعیت میتواند بسیاری از سیستمهای بدن شامل عروق خونی واعصاب را تحریک کند.
دیابت نوع یک در اثر سنتز ناکافی انسولین توسط سلولهای بتایپانکراس و دیابت نوع II در اثر مقاومت به انسولین ایجاد میشود.
یک گزارش از سراسر جهان نشان داده است که دیابت ملیتوس یک اختلال اندوکرینی شایع میباشد که هر ساله نزدیک به 10 درصد از جمعیت جهان را مبتلا میکند.[8] در حال حاضر حدود 150 میلیون نفر در سراسر جهان مبتلا به بیماری دیابت هستند و تخمین زده شده که این میزان تا سال 2025 به 300میلیون نفر برسد.
کربوهیدراتها یک بخش اصلی از رژیم غذایی انسان میباشند. به دنبال هضم غذا، آنزیمهای هیدرولیز کنندهی مختلفی بر کربوهیدراتها اثر میکنند و باعث تبدیل آنها به گلوکز و مونوساکاریدهای قابل جذب میشوند. یکی از این آنزیمها، آنزیم آلفا گلوکوزیداز - - EC 3.2. 1.20 میباشد که در رودهی کوچک با اثر بر کربوهیداراتهای پیچیده - الیگوساکاریدها و دیساکاریدها - ، منجر به تبدیل آنها به قندهای سادهی قابل جذب میشود که به این طریق نهایتا می-تواند باعث افزایش میزان قند خون گردد
آنزیمهای گلوکوزیداز بر اساس پیوندهای گلیکوزیدی که تجزیه میکنند به چند دسته تقسیم میشوند. این تقسیم بندی براساس تعداد، موقعیت و جایگاه فضایی گروه هیدروکسیل در سوبسترا می-باشد.
روشهای بسیاری توسط مطالعات داروشناختی شامل تحریک آزاد شدن انسولین، مهار گلوکونئوژنز، افزایش تعداد انتقال دهندههای گلوکز و کاهش جذب گلوکز از روده به منظور بهبودی بیماری دیابت مورد استفاده قرار گرفته است. مفیدترین روش برای کاهش جذب گلوکز، از طریق مهار آنزیمهای هیدرولیز کنندهی کربوهیدارتها مانند آلفا-آمیلاز و آلفا-گلوکوزیداز بوده است.
در سال 1970 توسط پیتزر و همکاران مشخص شد که مهار آنزیم آلفا-آمیلاز روده و یا پانکراس توسط مهارکنندهها باعث کنترل میزان جذب کربوهیدراتها میشود، و این مهارکنندهها برای درمان بیماری دیابت نوع II مورد استفاده قرار گرفتهاند. آزمایشات نشان داد که آکاربوز با کاهش گلوکز خون پس از صرف غذا و افزایش ترشح انسولین، در کاهش عوارض ناشی از دیابت نوع II اهمیت دارد. در سال 1996 آکاربوز در آمریکا تحت نام پرکوز به عنوان دارویی برای درمان دیابت مورد استفاده قرار گرفت.
بنابراین آکاربوز یکی از اولین داروهای کاهش عوارض دیابت بوده است. از دیگر مهارکنندههای این آنزیم میتوان به ووگلیبوز، نوجیرومایسین و میگلیتول اشاره کرد. در سالهای اخیر تلاشهای متعددی جهت یافتن مهارکنندههای آنزیم آلفا-گلوکوزیداز از منابع طبیعی، به دلیل داشتن عوارض جانبی کمتر و اثر سریع، صورت گرفته است. مطالعه حاضر با هدف بررسی اندامها و بخشهای مختلف هوایی گیاهان گل استکانیبرگهدار - Campanula - involucrate و سلین حبابی - - Silene Ampullata Bioss از نظر توانایی مهار کردن آنزیم آلفاگلوکوزیداز و یافتن اندام حاوی ماده موثرتر اس صورت گرفت.
تئوری و پیشینه تحقیق
مطابق نتایج یک مطالعه غربالگری برای فعالیت مهاری آلفا گلوکوزیداز در میان عصاره متانولی 60 گونه گیاه بومی استان کردستان، ده گیاه با فعالیت بالا معرفی شدند، که دو گیاه سلین حبابی و گل استکانیبرگهدار از آن جمله اند.
گیاه گلاستکانیبرگهدار - Campanula involucrate - از خانواده گل استکانی، گیاهانی علفی، یکساله، دوساله یا پایا و بندرت به صورت بوتههای چوبی، به ارتفاع حدود 1متر و گاهی دارای ساقه بالارونده هستند. این گیاهان در 1600 گونه و 60 جنس تقریبا نزدیک به هم در سراسر جهان پراکنده شدهاند. مهمترین جنس این تیره کامپانولا میباشد، که حدود 250 گونه دارد و مرکز انتشار آن تقریبا نواحی مدیترانهای است
گیاه سیلن حبابی - Silene Ampullata Bioss - از خانواده Caryophyllaceae و گیاهی یکساله است که اغلب در مکانهای علفی و خشک میروید و مقاوم به خشکسالی و تنش گرمایی است. سیلن بومی حوزه مدیترانه است ، سطح برگهای آن به طور خفیفی کرکدار ، برگها بادامی یا بیضوی شکل وزبر خشن به رنگ سبز درخشان هستند و گلهای آن ساده یا پرپر به صورت خوشهای به رنگ صورتی یا سفید تند هستند این گیاه در فصل بهار و تابستان میروید.
مواد و روشها
مواد شیمیایی وبیوشیمیایی
در این مطالعه آنزیم آلفا گلوکوزیداز ساکارومایسس سروزیه، سوبسترای پارانیتروفنیل آلفا دی گلوکو پیرانوزید - pNPG - ، آکاربوز، آلبومین سرم گاوی - BSA - که از شرکت سیگما-آلدریچ - Sigma- Aldrich - خریداری شدهاند، حلال متانول و سایر مواد شیمیایی از شرکت مرک - Merch - آلمان خریداری شدهاند.
جمعآوری گیاهان
در فصل بهار گیاهان گلاستکانیبرگهدار و سیلن حبابی از نواحی معینی از مراتع استان کردستان گردآوری و ضمن ثبت سیستماتیک به آزمایشگاه تحقیقاتی منتقل گردیدند. سپس اندامهای هوایی - گل، برگ و ساقه - از همدیگر تفکیک شدند. آنگاه این اندامهای تفکیک شده در شرایطی امن از نظر آلودگی میکروبی و به دور از نور آفتاب، به مدت چندین روز به طور کامل خشک گردیدند. پس از خشک شدن کامل، اندامها توسط آسیاب خانگی مولینکس، به صورت پودر نرم درآمده و در ظروف پلاستیکی دربدار تمیز تا زمان عصارهگیری در دمای اتاق نگهداری شدند.
عصاره گیری
جهت تهیهی عصاره متانولی، 30 گرم پودر تهیه شده از هریک از اندامهای هوایی گیاه در 150 میلی لیتر حلال متانول به مدت 24 ساعت در دمای اتاق نگهداری و در فواصل زمانی معینی همزده شدند. نمونهها پس از زمان طی شده توسط کاغذ صافی واتمن شماره 42 صاف شده و برای تغلیظ عصاره از دستگاه روتاری اواپراتور در دمای 65 درجه سانتی گراد بهمدت 30دقیقه و 58 دور در دقیقه استفاده گردید. پس از آن جهت خشک شدن کامل، عصارهها بر روی شیشه ساعت به قطر 15 سانتیمتر، پخش شده و در زیر هود شیمیایی قرار گرفتند. سپس عصارهها جمعآوری و در میکروتیوبهای 1/5 میلی لیتری در فریزر -20 درجه، جهت مراحل بعدی آزمایش، نگهداری شدند.
سنجش مهار آنزیم گلوکوزیداز
دراثر هیدرولیز سوبسترای پارانیتروفنیل آلفا-دی-گلوکوزیداز - - pPNG توسط آنزیم آلفاگلوکوزیداز، مادهی رنگی پارا-نیتروفنل تولید میشود که این ماده زرد رنگ میباشد ودارای جذب حداکثری در طول موج 405 نانومتر است. هر چه فعالیت این آنزیم بیشتر باشد شدت رنگ تولید شده و به دنبال آن جذب نوری نیز بیشتر میشود. در حضور عصاره گیاهی به علت کاهش فعالیت آنزیم آلفا گلوکوزیداز، مقدار کمتری سوبسترا تجزیه میشود و متعاقبا مادهی رنگی کمتری تولید میشود که خود باعث کاهش جذب نوری میشود. تمامی سنجشها در میکروپلیتهای 96 چاهکی و در حجم نهایی 150 میکرولیتر و با استفاده از دستگاه میکروپلیتخوان Tecan - مدل - Sunrise و به ترتیب زیر انجام شد:
50 میکرولیتر از بافر فسفات = 6/6 - - pH، 20 میکرولیتر از عصاره و 10 میکرولیتر از آنزیم آلفا گلوکوزیداز به چاهک تست افزوده شده، سپس برای مخلوط شدن کامل، میکروپلیت به مدت 5 ثانیه در درون دستگاه میکروپلیتخوان مرتعش شد و پس از 5 دقیقه انکوبهشدن در دمای 37 درجه سانتی گراد، 20 میکرولیتر از سوبسترای به هر چاهک تست افزوده شد. پس از 30 دقیقه انکوباسیون در دمای اتاق ، جهت توقف واکنش ، 50 میکرولیتر سدیم هیدروکسید به آن اضافه شد.
سپس برای اندازهگیری میزان جذب، میکروپلیت در دستگاه میکروپلیتخوان قرار گرفته و پس از 5 ثانیه همزدن،جذب آن به مدت 3 دقیقه و هر 1 دقیقه یکبار در طول موج 405 نانومتر اندازهگیری شد. سنجشها هر کدام در سه تکرار صورت گرفت و چاهک بلانک حاوی تمام مواد چاهک تست، منهای آنزیم - به جای آن مقدار 10 میکرولیتر بافر اضافه شد - بود. در تمامی سنجشها از کنترل منفی و بلانک آن و همچنین کنترل مثبت آکاربوز و بلانک آن استفاده شد.
تحلیل داده ها
پس از پایان سنجشها جذب پلیت خالی از جذب چاهکهای متناظر و همچنین جذب بلانک چاهکهای تست از جذب بلانک تست کسر شد. برای کنترل منفی نیز به همین طریق جذب نهایی محاسبه گردید. جذب بدست آمده برای نمونه تست و کنترل منفی علیه زمان ترسیم و در نهایت نموداری با یک خط راست بدست آمد. برای تعیین میزان مهارآنزیم توسط عصاره، از معادله - 1 - استفاده شد.
