بخشی از مقاله
چکیده:
اینترفرونها وسیله دفاعی بدن علیه ویروسها میباشند که به سرعت در بدن تولید شده، سلولهاي اطراف را به تولید پروتئینهائی که تکثیر ویروس را مهار، یا پاسخ ایمنی و رشد سلولی را کنترل میکنند، تحریک میکنند. در این پژوهش، ژن اینترفرون آلفا2b پس از تکثیر با آغازگرهاي اختصاصی در ناقل بیانی pET-26b - + - تحت کنترل پروموتور T7 و پپتید نشانه پریپلاسمی pelB و با استفاده از آنزیمهاي برشی NcoI و XhoI کلون گردید. سازه تهیه شده به باکتري اشرشیاکلی سویه BL21 - DE3 - منتقل گردید. همسانهسازي ژن اینترفرونآلفا در ناقل بیانی - pET-26b - + با استفاده از Colony PCR، هضم آنزیمی و تعیین توالی، تأیید شد. سپس بیان ژن اینترفرونآلفا با استفاده از آنالیز بلات نقطهاي در فضاي پریپلاسمی و بصورت پروتئین کل در زمانهاي مختلف پس از القاء با IPTG موردبررسی قرار گرفت. با استفاده از این روش مشخص شد که اینترفرون آلفا2b در سیستم بیانی باکتري تولید شده و وارد فضاي پریپلاسمی باکتري شده است. با انجام این تحقیق با هدف بهینهکردن تولید اینترفرونآلفا در باکتري اشرشیاکلی، میتوان زمینه را براي تولید سایر پروتئینها فراهم کرد. تولید این پروتئین سلولی مهم در آزمایشگاه، کاربردهاي مهمی را در تولید پروتئینهاي نوترکیب دارویی خواهد داشت.
کلید واژه ها: اینترفرون آلفا2b، - pET-26b - +، اشرشیاکلی، .IPTG
مقدمه وهدف:
اینترفرونها پروتئین هاي تولید شده توسط سیستم ایمنی بدن هستند که در پاسخ به عفونت ویروسی، سلولهاي بیگانه، آنتیژنها و یا سلولهاي سرطانی ساخته و رها میشوند - . - 18 اینترفرون آلفا-2b، از خانواده اینترفرونهاي نوع یک یا اینترفرونهاي لکوسیتی میباشد که در پاسخ به بسیاري از عوامل عفونی بیان میشود و بسیاري از عملکردهاي زیستی مثل جلوگیري از همانندسازي ویروس، جلوگیري از پیشرفت سرطان و دیگر عملکردهاي ایمونولوژي را انجام میدهند و درنتیجه یکی از داروهاي زیستی مورداستفاده براي درمان بیماريهایی مثل کم خونی سلولهاي موئی شکل1، هپاتیت B مزمن2 و هپاتیت C مزمن3 میباشند - . - 6 به منظور تولید پروتئینهاي نوترکیب، سیستمهاي بیانی مختلفی توسط دانشمندان استفاده و بطور تجاري بهرهبرداري شدهاند - . - 10مزیتهاي بسیاري براي استفاده از سیستم بیانی اشرشیاکلی به اثبات رسیده است.
ویژگیهاي ژنتیکی و فیزیولوژیکی املاًک شناخته شدهینا باکتري، تکثیر درزمان کوتاه، آسان بودن دستورزي آن، دانش اثبات شده فرمانتاسیون و نهاتاًی ظرفیت بالا براي تجمع پروتئینهاي نوترکیب - بیش از %20 از محتواي پروتئین کل سلولی - ، اشرشیاکلی را یکی از پرکاربردترین میزبان ها جهت تولید پروتئین نوترکیب ساختهاست - 2و. - 3 امکان تولید پروتئین در سلول نیز از اهمیت بالایی برخوردار است . پروتئین نامتجانس4 میتواند در سیتوپلاسم یا در پریپلاسم تولید شده و یا به خارج از سلول ترشح شود - . - 6 ایجاد اجسام نامحلول5، یکی از مشکلات عمده در مسیر تولید پروتئین بصورت سیتوپلاسمی است. زیرا دوباره تاخوردن6 پروتئینهاي مجتمع شده کار مشکل و دشواري میباشد. 5 - و. - 6 تخلیص پروتئینی که بصورت پریپلاسمی صورت میگیرد، راحتتر است.
بیان در پریپلاسم، فضاي عالی براي تشکیل پیوندهاي صحیح و پیچش صحیح ایجاد میکند. ناخالصی پروتئین و فعالیت پروتئازها در پریپلاسم کمتر از سیتوپلاسم است و تخریب و تجزیه پروتئینها در پریپلاسم کمتر اتفاق میافتد - . - 5 باتوجه به اهمیت دارویی اینترفرون آلفا 2b انسانی در ایران و جهان، تولید این دارو در داخل کشور و از طریق بیوشیمیایی امکانپذیر اما بسیار مشکل میباشد زیرا تولید این پروتئین توسط سلولهاي سالم بسیار کم انجام میشود بنابراین راه آسانتر براي نیل به این هدف استفاده از روشهاي مهندسی ژنتیک است. هدف از این تحقیق، همسانهسازي1 و بیان ژن اینترفرون آلفا 2b انسانی در باکتري اشرشیاکلی تحت کنترل پروموتر T7 و پپتید نشانه پریپلاسمی2pelB جهت امکان هدایت پروتئین تولیدشده به فضاي پریپلاسمی باکتري است.
.روش تحقیق:
باکتريها: در این تحقیق از باکتري اشرشیاکلی، سویه هاي DH5 و BL21 - DE3 - استفاده شد. از سویه DH5 بعنوان میزبان براي نگهداري و تکثیر سازه هاي تهیه شده و ازسویه BL21 - DE3 - جهت بیان ژن اینترفرون استفاده شد.
آغازگرها: جهت تکثیر ژن اینترفرون، از آغازگر پیشرو'5'-CATGCCATGGCATGTGATCTGCCTCAAACC-3و آغازگرمعکوس 5'-GCAACCGCTCGAGTTGTTGTTCCTTACTTCTTAAAC-3' استفادهگردید آغازگر پیشرو داراي جایگاه برشی براي آنزیم NcoI و آغازگر معکوس داراي جایگاه برشی براي آنزیم XhoI بود. جهت افزایش کارآیی برش آنزیمهاي برشی، دو توالی اضافی به عنوان لنگرگاه آنزیم به دوطرف آغازگر افزوده گردید. همچنین براي تسهیل در تخلیصپروتئین در مراحل بعدي پژوهش، از دو اسید آمینه گلوتامیک اسیدکه براي برش توالی نشانه هیستیدین توسط کیت شرکت
کیاژن در نظر گرفته شده است ،پس از توالی Histag در آغازگر برگشتی استفاده شد.
ناقلها: در مطالعه حاضر از یک ناقل بیانی بنام pET-26b - + - - شکل - 1استفاده گردید. این ناقل داراي ژن مقاومت به کانامایسین در باکتري، محلهاي برش براي آنزیمهاي NcoI و XhoI، پیشبر T7 lacبراي افزایش نسخهبرداري و پپتید نشانه پریپلاسمی pelB براي هدایت پروتئین تولید شده به فضاي پریپلاسمی میباشد.
روش کار:
تکثیر وهمسانه سازي ژن اینترفرون آلفا2b در ناقل :pET-26b - + - تکثیرDNA توسط دستگاه ترموسایکلر و با استفاده ازآغازگرهاي اختصاصی طراحی شده انجام گردید. محصول PCR و ناقل با استفاده از آنزیم هاي برشی NcoI و XhoI بطور جداگانه هضم گردیدند و با استفاده از کیت تخلیص از ژل خالص سازي شدند. و در نهایت محصول PCR درناقل بیانی pET-26b - + - ، با استفاده از آنزیم T4 DNA Ligase کلون گردید. پلاسمید نوترکیب ایجاد شده در باکتري اشرشیاکلی سویه BL21 - DE3 - ترانسفورم شد.بررسی بیان ژن اینترفرون آلفا:2b در این تحقیق، براي تهیه پروتئینهاي کل، یک کلونی از باکتري تراریخته و رشد یافته بر روي محیط گزینشگر، در 1 میلی لیتر محیط مایع TB حاوي کانامایسین - 50 میکروگرم درمیلی لیتر - کشت داده شد و در انکوباتور 37ºC شیکردار در دور 250 rpm به مدت یک شب قرار داده شد.
سپس به کشت شب قبل 50 میلی لیتر از محیط کشت مایع TB کانامایسین دار افزوده شد تا زمانی که غلظت آن در O.D600 به 0/4 تا 0/6 رسید. 1 میلی لیتراز نمونه کشت به مدت 10 دقیقه با دور 7000 rpm سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل، بعنوان نمونههاي غیر القایی وکنترل منفی استفاده شد. به مابقی کشت IPTG با غلظت نهایی1 میلیمولار اضافه گردید. در فواصل زمانی 2،1، 4، 8 و 15 ساعت بعد از القاء ، هربار 1میلی لیتر از کشت باکتري برداشته شد. تمامی نمونه ها به مدت 10 دقیقه با دور 7000 rpm سانتریفیوژ شدند رسوب حاصل بعنوان نمونه هاي القایی استفاده شدند.جهت تهیه پروتئینهاي پریپلاسمی، از نمونه کشتهاي باکتریایی پس ازگذشت 15 ساعت از القاء و به روش شوك اسمزي استفاده گردید. و در نهایت نمونههاي پروتئین بدستآمده از باکتري، با استفاده ازآنالیز بلات نقطهاي مورد ارزیابی قرارگرفتند.
نتایج:
تکثیر و همسانه سازي ژن اینترفرون آلفا2b در ناقل : pET-26b - + - ژن اینترفرون آلفا2b بااستفاده از آغازگرهاي اختصاصی تکثیر گردید. پس ازانجام هضم آنزیمی ناقل و ژن، طی فرایند اتصال، ژن اینترفرون وارد ناقل pET شد و به میزبان باکتري اشرشیاکلی سویه BL21 - DE3 - منتقل گردید. همسانهسازي ژن اینترفرون آلفا در ناقل pET-26b - + - ، با استفاده ازروشهاي Colony PCR - شکل 2 الف - ، هضم آنزیمی توسط آنزیم هايNcoI و XhoI - شکل 2 ب - و تعیین توالی تأیید گردید.
شکل -2 الف- تأیید حضور ژن اینترفرون آلفا در اشرشیاکلی با استفاده از تکنیک Colony PCR با آغازگرهاي اختصاصی. چاهک -M نشانگر مولکولی 100 bp چاهک-1 آب - کنترل منفی - چاهک-2کنترل مثبت - ناقل . - pETIFNα چاهکهاي -3-8کلونیهاي باکتري حاوي ژن اینترفرون آلفا
.شکل -2 ب- تأیید حضور ژن اینترفرون آلفا در اشرشیاکلی با استفاده از هضم آنزیمی. چاهک M، نشانگر مولکولی 1kb، چاهک 1، خروج ژن اینترفرون از پلاسمید پس از انجام هضم آنزیمی، چاهک 2، پلاسمید فاقد ژن، چاهک 3، ژن اینترفرون آلفا.بررسی بیان ژن اینترفرون آلفا با استفاده از بلات نقطهاي: در این روش، بیان ژن در زمانهاي مختلف مشاهده گردید در حالیکه در کنترل منفی - باکتري حاوي ناقل بدون ژن - بیان ژن دیده نشد - شکل -3الف - .بررسی ترشح ژن اینترفرون آلفا در فضاي پري پلاسمیک: بیان سیتوپلاسمی و پریپلاسمی پروتئین اینترفرون آلفا، 15 ساعت پس از القاء مورد بررسی قرار گرفت. ابتدا به روش شوك اسمزي اجزاء این دو فضا را از یکدیگر جدا گردید و سپس با استفاده از روش بلات نقطه اي مشخص شد که اینترفرون آلفا2b وارد فضاي پریپلاسمی باکتري شده است - شکل-3ب - .
