بخشی از مقاله
مقدمه
بیماری فشار خون یک فرآیند چند فاکتوره است و دلیل اصلی بیماری در کشورهای صنعتی میباشد. جمعیت مبتلا به فشار
-1 استادیار فرآوری محصولات شیلاتی، دانشکده علوم دریایی، دانشگاه دریانوردی و علوم دریایی چابهار، چابهار،
ایران taheri@cmu.ac.ir
-2 دانشجوی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی زاهدان، واحد چابهار(سینا)، چابهار، ایران -3 دانشکده علوم و صنایع غذایی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران
خون در جهان در سال 2000 میلادی 972 میلیون نفـر بـوده
است و تخمین زده میشود در سـال 2025 بـه 1/56 بیلیـون نفر برسد(.(10 در حال حاضـر 15 تـا %20 جمعیـت بـالغین جهان از این بیماری رنج مـیبرنـد(.(18 آنـزیم تبـدیل کننـده
آنژیوتنسین I نقش مهمی در تنظیم و افزایش فشار خـون ایفـا میکند. این آنزیم عامل کاتالیز کننده آنژیوتنسین I غیر فعال به آنژیو تنسین II فعال میباشد که منقـبض کننـده قـوی عـروق
است((8 و غیر فعال کننده برادی کینین میباشد که یک متسـع
کننده قوی عروق است(.(35 مهارکنندههای ACE سنتزی مثل کاپتوپریل و آنالاپریل برای بیماری فشار خون استفاده میشـود
اما اثرات جانبی متفاوت زیادی دارد کـه شـامل سـرفه، تغییـر
حس چشایی، جوش و ادم پوستی مـیشـود (22) و بنـابراین علاقه زیادی به مهارکنندههای طبیعی وجود دارد.
از سوی دیگر امروزه بیماریهای مرتبط با رادیکالهـای آزاد باعث آسیبهای جدی به بدن می شوند که میتواند منجر به
سرطان و یا رنج گستردهای از بیماریهـای دیگـر گـردد(.(2
همچنین اکسیداسیون اسیدهای چرب بـا رادیکـالهـای آزاد
منجر به تغییر کیفیت غذا مـی گـردد و روی سـلامت انسـان تاثیر منفی دارد. بنابراین یافتن آنتی اکسیدانهای طبیعی برای جایگزینی با آنتی اکسـیدانهـای صـناعی در صـنایع غـذایی بسیار مورد توجه است .(31) بسیاری از آنتـی اکسـیدانهـای
سنتزی میتوانند بـرای جلـوگیری از فعالیـت پراکسـیدانهـا بـه شیوههای مختلف به کار رونـد. امـا مسـائل سـلامت و نگرانـی مصـرفکننـدگـان از مصـرف محصـولات سنتـزی مصنـوعـی
599
علی طاهری، سمیرا جلالینژاد، سیدامیرعلی انوار
محدودیتهایی را برای استفاده از این مواد بوجود آورده اسـت. امروزه علاقه زیادی برای شناسایی منابع جدیـد و طبیعـی آنتـی
اکسیدان از صنایع لبنـی، گیاهـان و جـانوران بوجـود آمـده کـه
تحقیقات گستردهای را در سالهای اخیر به خود اختصاص داده است(.(31
علوم تغذیه جدید به سمت "تغذیه بـرای سـلامت بهینـه" گـام برمیدارد و به سوی درمان بیماریها یا پیشگیری از آنهـا سـوق دارد. بر این اساس پپتیدهای زیست فعال بیولوژیـک فراوانـی از
بســیاری غــذاهای طبیعــی و فــرآوری شــده اســتخراج شــده
است(.(14 عموماً این پپتیدها علاوه بر عملکردشـان بـه عنـوان غــذا مــیتواننــد تــاثیر فیزیولوژیــک داشــته باشــند. تمــامی ایــن
پپتیدهای زیست فعال در ساختار پروتئین مادری خود غیرفعالند
و میتوانند توسط هضم رودهای یا آبکافت توسط پروتئازهـا بـه شکل فعال درآیند. پپتیدهای مهارکننده آنزیم تبدیل کننـده آنژیـو تنسین I از این پپتیدها میباشند. بنـابراین تمـامی پپتیـدهایی کـه این توانایی را داشته باشند میتواننـد در نهایـت فشـار خـون را کــاهش دهنــد. پپتیــدهای بــا خــواص آنتــی اکســیدان از دیگــر پپتیدهایی هستند که با حذف رادیکالهای آزاد عامل اکسایش از
بیماریهای بسیاری جلو گیری میکنند.
مطالعات متعدد نشان از فعالیت مهار آنزیم ACE پـروتئینهـای
آبکافــت آبزیــان، گوشــت کوســه (37)، کپــور علفخــوار (5)،
گوشت شانک (12)، ژلاتین اسـکوئید (19)، ژلـه مـاهی (16) و... میباشد همچنین مطالعات بسیاری بر خواص آنتی اکسـیدان پروتئین آبکافت آبزیان مثل سرخوی قرمز پهلـو قهـوهای (12)،
مارماهی شنی (16) و... تاکید دارد و اثبات شده که هـردو ایـن
اثرات با هم میتوانند اثر ضد فشار خون در محیط زنـده داشـته باشند(.(9
میگو یکی از سخت پوستان اصلی پرورشی در ایـران اسـت کـه ضـایعات مشخصـی را پــس از فـرآوری میگــوی بـدون ســر و
پوسته بهجا میگـذارد. ایـن ضـایعات غنـی از پـروتئین و پلـی ساکاریدهایی چون کیتین است که در صـورت بازیـابی مزایـای
اقتصادی بسیاری خواهند داشت. لذا در این تحقیـق بـه بررسـی
اثرات ضـد اکسـیدانی و مهـار کننـدگی آنـزیم آنژیـو تنسـین I
پروتئین آبکافت ضایعات میگـوی سـفید هنـدی پرداختـه شـده است.
مواد و روش کار
مواد اولیه
ضایعات میگوی سفید هندی شامل سر از بازار آبزیان شهرسـتان
چابهار به صورت تـازه تهیـه شـد و تـا زمـان مصـرف در -20
درجه سانتی گراد نگهداری شد.
آبکافت
1500 گرم ضایعات میگوی سفید هندی در یک چرخ گوشـت چرخ شد و سپس به ارلن مایرهای 250 میلیلیتری اضافه شـد. ارلنها برای 20 دقیقه در 85 درجـه سـانتی گـراد گرمـا دهـی شدند تا آنزیمهای داخلی آن غیر فعال گـردد و چربـی گوشـت آزاد شود(.(32 نمونهها در دمای اتاق خنـک شـدند. هـر نمونـه حاوی نسبت 1:1 از 100 گرم ضایعات بـا آب مقطـر بـود کـه پس از اضافه کردن مقدار مورد نیاز آنزیمهـای آلکـالاز، پپسـین،
آلفا کیموتریپسین، نئوتراز، فلاووروزایم در دما و زمان مشـخص
انکوباسیون شد. پس از زمان مورد نیاز تیمار مخلـوط در حمـام آبی 90 درجه سـانتی گـراد قـرار گرفـت و آنـزیمهـا غیرفعـال گردیدند. پروتئین آبکافت ماهی پس از سانتریفوژ جدا گردید.
تعیین درجه آبکافت و بازیافت نیتروژن
به 0/5 میلیلیتر از سوپرناتانت حاصـله بعـد از هیدرولیزاسـیون 0/44 مول در لیتر تری کلرواستیک اسـید اضـافه شـد. مخلـوط
برای سی دقیقه در دمای اتاق انکوبه و سـپس در 4500 دور در
دقیقه 5) دقیقه) سانتریفوژ گردیـد. محلـول 0/22 مـول در لیتـر
تری کلرو استیک اسید حاصله برای تعیین محتـوای پـروتئین بـا
روش بیوره سنجیده شد و از آلبـومین سـرم گوسـاله بـه عنـوان
استاندارد پروتئین استفاده گردید. بر این اسـاس 4/5 میلـی گـرم سدیم پتاسیم تارتارات، 1/5 میلی گرم سولفات مس 5 آبه، 2/5
600
خواص ضد فشار خون و ضد اکسیدان پنج نوع آبکافت حاصل از ضایعات میگوی سفید هندی((Penaeus indicus
میلی گرم یدید پتاسیم در 200 میلـی لیتـر محلـول 0/2 مـولار
سود حل شد و به حجم 500 سی سی رسـانده شـد. بـه 500
میکرولیتر از محلول پروتئینی 4/5 میلـی لیتـر محلـول سـنجش افزوده شد و پس از 20 دقیقه در 550 نـانومتر توسـط دسـتگاه
اسـپکتروفتومتر (Jenway, 6305, UK) قرائـت شـد. درجـه
آبکافت با فرمول زیر سنجیده شد .(34)
بازیافت نیتـروژن بـر اسـاس روش (18) طبـق فرمـول زیـر
سنجش شد:
فعالیت حذف رادیکال آزاد دیفنیل پیکریل هیدرازیل - ,
diphenyl- -picrylhydrazyl (DPPH)
جهت بررسی فعالیت حذف رادیکال آزاد محلول حاوی
رادیکال آزاد 1/5) DPPH میلی لیتر، 0/1 میلی مولار در
اتانول (%95 با نمونه مخلوط گردید 1/5) میلی لیتر در غلظت های متفاوت نمونه در اتانول .(%50 مخلوط تکان داده شد و پس از 30 دقیقه در دمای اتاق جذب در 517 نانومتر سنجیده گردید. برای کنترل محلول اتانول به جای
نمونه به کار رفت. بوتیل هیدروکسی تولوئن در غلظت
0/02 میلی گرم بر میلی لیتر برای مقایسه استفاده شد .(29) فعالیت حذف رادیکال آزاد بر اساس فرمول 1 سنجیده شد:
×100 A517 sample DPPH radical scavenging capacity % = 1-
(1) control A517
سنجش فعالیت مهار کنندگی آنزیم تبدیل کننده آنژیوتنسینI
50 میکرولیتر محلـول هیـدرولیزات بـا 50 میکرولیتـر محلـول
25) ACE واحــد/میلی لیتــر) مخلــوط شــد و 5 دقیقــه در 37
درجه انکوبه شد و سـپس بـا 150 میکرولیتـر سوبسـترا Hip-) 8/3 His-Leu میلی مولار در بافر سدیم بورات 50 میلی مولار) برای 60 دقیقه در دمای مشابه انکوبه شـد. واکـنش بـا افـزودن
250 میکرولیتر محلول 1 مولار اسید کلریـدریک متوقـف شـد.
هیپوریک اسید حاصله با 0/5 میلی لیتر استیل اسـتات اسـتخراج
شد. بعـد از سـانتریفوژ در 3000 دور در دقیقـه بـه مـدت 15
دقیقه 0/2 میلی لیتر از لایه بالایی به لوله آزمایش منتقـل شـد و در 80 درجه سانتی گراد برای 1 ساعت خشک شد. هیپوریـک
اسید در 0/5 میلی لیتر آب مقطـر حـل شـد و جـذب در 228
نانومتر توسط اسپکتروفتومتر ماورای بنفش قرائت شد. Lc 50 بـه عنوان غلظتـی کـه بـرای مهـار %50 فعالیـت ACE نیـاز اسـت گزارش شد .(15)
پایداری پپتیدها در هضم توسط آنزیم های دستگاه گوارش
محلول %1 پپسین در بافر 0/1 میلی مـولار Hcl-Kcl در 2 =pH
تهیه شد و محلول %1 کیموتریپسـین در بـافر 0/1 میلـی مـولار NaoH-Kcl در 7=pH تهیه شد. پپتیدها در 0/02 میلی گـرم در میلی لیتر محلول ها حل شـد و بـرای 4 سـاعت در 37 درجـه
سانتی گراد واکنش یافت. واکنش با 15 دقیقه جوشاندن خاتمـه
یافت. بعـد از 25 دقیقـه سـانتریفوژدر g 12000 سـوپرناتانت
خنثی شد و برای سنجش مهار ACE به کار رفت .(15)
سنجش پروفیل اسیدهای آمینه
آنالیز ترکیب اسید آمینه کل با اسـتفاده از دسـتگاه کرمـاتوگرافی مایع بـا نفـوذ بـالا (HPLC) و شناسـاگر فلئورسـنت (Agilent) انجام گرفت. نمونه ها توسط اسید کلریدریک 6 نرمـال در 110 درجه سانتی گراد هیدرولیز و توسط ستون فاز معکـوس (C18)
کرماتوگراف شدند. محتوای تریپتوفان بعد از هیدرولیز نمونه هـا در محلول هیدروکسید سـدیم 4/2 نرمـال و سیسـتین پـس از تیمار با محلول پرفورمیک اسـید سـنجش شـد. بـرای سـنجش
اسیدهای آمینـه آزاد نمونـه هـا در اسـید کلریـدریک همـوژن و سپس با اسید حاوی استاندارد داخل نورلوسین 160 میکرومول
در لیتر مخلوط شد. نمونهها در 4) 12000 × g درجـه سـانتی
گراد برای 15 دقیقه) سانتریفوژ و سوپرناتانت توسـط فیلتـر 10 کیلو دالتونی فیلتر شد. سوپرناتانت توسط دسـتگاه کرمـاتوگرافی
مایع با نفوذ بالا سنجش گردید .(32)
آنالیز آماری
601
علی طاهری، سمیرا جلالینژاد، سیدامیرعلی انوار
از آنالیز واریـانس یـک طرفـه و معنـی داری در سـطح %95
توسط نـرمافـزار version 5/01) Graphpad prism، 2007،
(Graphpad software Inc جهت آنالیز آماری استفاده گردیـد. از آزمون دانکن جهت شناسایی گروه های با اختلاف معنیدار استفاده شد. از آزمون تی جفتی جهـت بررسـی فعالیـت مهـار
ACE قبل و بعد از هضم با آنزیمهای گوارشی استفاده شد.
نتایج
درجه آبکافت و بازیافت نیتروژن
نتایج درجه آبکافت و بازیافت نیتروژن توسط 5 آنزیم مورد استفاده در جدول 1 آورده شده است. درجه آبکافت پروتئین حاصل از آنزیم آلکالاز با 4 آنزیم دیگر اختلاف معنی داری دارد و بیشتر است (p<0/05) اما درجه آبکافت 4 آنزیم دیگر اختلاف معنی داری نشان نداد .(p>0/05) بازیافت نیتروژن پروتئین آبکافت حاصل از فعالیت آنزیم آلکالاز و نئوتراز نیز بیشترین بوده و با سه تکرار دیگر اختلاف معنیداری دارد (p<0/05) اما دیگر آنزیمها اختلافی نشان ندادند(.(p>0/05
جدول -1 میزان درجه آبکافت و بازیافت نیتروژن پروتئین آبکافت ضایعات میگوی سفید هندی با آنزیم های مختلف (%)
آلکالاز پپسین آلفا- کیموتریپسین نئوتراز فلاووروزایم
درجه آبکافت 1/4a 64/2 1 /6 b 54/2 0 /9 b 48/6 0 /4 b 50/1 2 /1 b 47/3
بازیافت نیتروژن 1/6 a 75 2 b 60 1 /2 b 61 1 a b 66/6 0 /9 b 59
نتایج به صورت انحراف معیار میانگین است. تیمارهای با حروف هم نام در هر ردیف فاقد اختلاف معنی دار در سطح معنی داری %95 می باشند.
فعالیت آنتی اکسیدانی و مهار کنندگی آنزیم تبدیل کننده آنژیوتنسین I
فعالیت حذف رادیکال آزاد DPPH و مهار ACE در جـدول 2 آورده شده است. بر طبق نتایج پروتئین آبکافت حاصـل از آنزیم آلکالاز و کیموتریپسین بالاترین فعالیت آنتی اکسیدانی را نشان داده که با تمامی تیمارهای دیگر اختلاف معنـیداری
دارد .(p<0/05) پـــروتئین آبکافـــت حاصـــل از فعالیـــت آنزیمهای نئوتراز و فلاووروزایم با یکـدیگر اخـتلاف معنـی
داری نشان ندادند (p>0/05) اما پروتئین آبکافت حاصـل از
فعالیت پپسین کمترین فعالیت حذف رادیکـال ازاد را نشـان داد و با تمامی تیمارهای دیگر اخـتلاف معنـی داری داشـت .(p<0/05) نتایج مهار %50 فعالیت آنزیم تبدیل کننده آنژیو تنسین I نیز نشان داد که پروتئین آبکافـت حاصـل از آنـزیم آلکالاز و کیموتریپسین بیشترین تـاثیر مهـار کننـدگی را دارا هســتند و آنــزیم هــای نئــوتراز، پپســین و فلاووروزایــم در مقام های بعدی می باشند که هر سـه بـا هـم و بـا دو آنـزیم اولین دارای اختلاف معنیدار میباشند .(p<0/05)
جدول -2 فعالیت آنتی اکسیدان و مهار ACE پروتئین آبکافت ضایعات میگوی سفید هندی با آنزیم های مختلف
آلکالاز پپسین آلفا- کیموتریپسین نئوتراز فلاووروزایم
فعالیت حذف رادیکال آزاد (%) DPPH 1/2a 47/1 0 /2 c 27/2 0 /3 a 45/1 1 /1 b 40/2 2 b 36/3
Lc50 مهار ACE (میلی گرم در میلی لیتر) 0 /02 a 0/85 0 /12 b 3/26 0 /04 b 0/9 0/41 ab 2/91 0 /07 b 5/18
نتایج به صورت انحراف معیار میانگین است. تیمارهای با حروف هم نام در هر ردیف فاقد اختلاف معنی دار در سطح معنی داری %95 می باشند
