بخشی از مقاله
خلاصه :
این تحقیق به منظور جداسازي HindIII SatDNA از ژنوم تاسماهی روسی1 و تعیین توالی آن انجام شد. براي انجام این تحقیق 20 عدد تاسماهی روسی 2-3 ساله با میانگین طولی47/60±9/02 سانتیمتر و میانگین وزنی578/94 ±414/46 گرم بطور تصادفی جدا و در یک وان فایبرگلاس500 لیتري نگهداري شدند. به منظور استخراج HindIII SatDNA پس از استخراج DNA ژنومی از باله دمی تاسماهی روسی به روش فنل- کلروفرم و بررسی کمی و کیفی آن با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز و دستگاه نانودراپ، DNA استخراج شده به روش PCR تکثیر شد. پس از اطمینان از مطلوب بودن کیفیت محصول PCR ، در مرحله بعد به منظور تثبیت توالی قطعه بدست آمده - HindIII SatDNA - کلونینگ آن انجام و پلاسمید نوترکیب پس از استخراج تعیین توالی شد تا در تحقیقی دیگر به عنوان یک پروب FISH براي دو رگه گیري با کروموزومهاي تاسماهی روسی و تاسماهی ایرانی2 مورد استفاده قرار گیرد. بررسی توالی DNA ماهواره اي جدا شده از تاسماهی روسی حاکی از وجود 168 جفت باز - 168bp - در قطعه مذکور بود که این توالی در بانک ثبت ژن NCBI با شماره FJ594465 به ثبت رسید.
واژگان کلیدي: دریاي خزر، تاسماهی روسی، HindIII SatDNA
مقدمه
DNA ماهواره اي - SatDNA - توالی هاي غیرکدکننده و تکراري هستند که عمدتاً در مناطق هتروکروماتیننظیر سانترومرها و تلومرها مشاهده می شود. چنانچه یک SatDNA بطور مشترك در چندین گونه وجود داشته باشد می تواند براي بررسی فیلوژنی آنها مورد استفاده قرار گیرد . - 1 - در تاسماهیان یک SatDNA با استفاده از آنزیم HindIII ابتدا از ژنوم تاسماهی آدریاتیک3جدا شد . - 3 - بعدها وجود DNA ماهواره اي مذکور در ژنوم چندین گونه از تاسماهیان از جمله تاسماهی روسی نیز اثبات شد - . - 5 هدف از انجام این تحقیق جداسازي DNA ماهواره اي مذکور - HindIII SatDNA - از ژنوم تاسماهیان روسی صید شده در آبهاي سواحل جنوبی دریاي خزر - سواحل ایران - ، تعیین توالی و کلونینگ آن بود تا بتوان در تحقیقی دیگر از آن به عنوان یک پروب FISH براي دو رگه گیري با کروموزومهاي تاسماهی روسی و تاسماهی ایرانی استفاده نمود.
مواد و روش کار
براي انجام این تحقیق،20 عدد تاسماهی روسی 2-3 ساله با میانگین طولی47/60±9/02 سانتیمتر و میانگین وزنی 578/94 ±414/46 گرم بطور تصادفی جدا و در دو عدد وان فایبرگلاس500 لیتري نگهداري شدند. به منظور استخراج HindIII SatDNA از ژنوم تاسماهی روسی، ابتدا پرایمرهاي مورد نیاز با توالی - F - 5`-CTT TTT CAA ACT TTC GGG GC-3`، - R - 5`- CTT CA GAT TCG TTC CTG TC-3` طراحی و سفارش ساخت آن به یکی از شرکتهاي سازنده پرایمر داده شد. پس از خرید و تحویل گرفتن پرایمرهاي سفارش داده شده، DNA ژنومی از باله دمی تاسماهیان روسی مورد آزمایش به روش فنل- کلروفرم - 4 - استخراج و با استفاده از پرایمرهاي مذکور به روش PCR تکثیر شدند. مخلوط واکنش PCR شامل یک واحد آنزیم TaqDNA polymerase ، 0/1 میلی مولار dNTPs، 20 پیکومول از هر پرایمر، بافر - 1× - PCR، 1/5 میلی مو MgCl2 لار ، 0/1 میکروگرم DNA ژنومی و آب مقطر بود.
واکنش PCR شامل یک مرحله واسرشته سازي - دناتوراسیون - اولیه DNA در دماي 94 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه متعاقب آن 30 مرحله شامل مرحله واسرشته سازي DNA در دماي 94 درجه سانتیگراد به مدت30 ثانیه، مرحله الحاق پرایمرها در دماي52 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه، مرحله بسط - Extention - پرایمرها در دماي 72 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه و یک مرحله به عنوان بسط انتهایی در دماي 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه انجام گردید.
پس از مشاهده باند اختصاصی مربوط به HindIII SatDNA بر روي ژل آگارز، قطعه بدست آمده از روي ژل جداسازي و در پلاسمید pBluescript کلون شد. پس ازترانسفرماسیون, غربالگري باکتري هاي حاوي پلاسمید نوترکیب با استفاده از Xgal–IPTG انجام گرفت و کلنی هاي سفید رنگ که حاوي پلاسمید نوترکیب بودند انتخاب شدند. از باکتریهاي حاوي پلاسمید نوترکیب، استخراج پلاسمید انجام شد و با انجام PCR با پرایمرهاي اختصاصی ژن و همچپنین پرایمرهاي یونیورسال پلاسمید، کلونینگ ژنهاي فوق تایید گردید. در مرحله بعد از پلاسمید هاي نوترکیب کشت انبوه بعمل آمد و با روش الکالین پلاسمید ها استخراج و براي تعیین توالی ارسال شدند.
نتایج و بحث
نتایج حاصل از تعیین توالی قطعات ژنی در پلاسمیدهاي نوترکیب حاکی از وجود 168 جفت باز در SatDNA جدا شده از ژنوم تاسماهی روسی مورد آزمایش در این تحقیق بود. توالی قطعه مذکور در بانک ثبت ژن NCBI با شماره FJ594465 به ثبت رسید. HindIII SatDNAقبلاًدر اکثر گونه هاي جنس Acipenser از جمله تاسماهی استرلیاد4، تاسماهی آدریاتیک، تاسماهی سیبري5، تاسماهی سفید6، تاسماهی روسی - - 2، ماهی ازون برون7، تاسماهی دریاچه اي8، تاسماهی پوزه کوتاه9 و تاسماهی چینی10 توسط - - 6 نیز شناسایی و جدا شد. از آنجایی که DNA ماهواره اي مذکور در اکثر گونه هاي جنس Acipenser وجود دارد لذا برخی از محققین آن را DNA ماهواره اي اختصاصی این جنس می دانند و معتقدند می توان از آن براي بررسی فیلوژنی این ماهیان استفاده نمود تا جاییکه برخی محققین از جمله - 2 - الگوي تکاملی آن را در تاسماهی آدریاتیک، تاسماهی سیبري، تاسماهی استرلیاد، تاسماهی اروپا، تاسماهی سفید و تاسماهی روسی بررسی کردند. HindIII SatDNA استخراج شده از تاسماهی روسی در تحقیق حاضر داراي 168 جفت باز بود و با توالی HindIII SatDNA جدا شده از تاسماهی روسی توسط - 2 - داراي %88 تشابه بود به عبارت دیگر در 151 جفت باز مشابه همدیگر بودند - جدول . - 1
تشکر و قدردانی
بدینوسیله از تمامی بزرگوارانی که در طول انجام این تحقیق ما را یاري نمودند از جمله رییس و معاون محترم پژوهشی موسسه تحقیقات شیلات ایران بخاطر پشتیانی مالی و تجهیزاتی این تحقیق، همچنین از مسئولین و کارشناسان محترم بخشهاي تکثیر و پرورش، اکولوژي، بهداشت و بیماریهاي آبزیان و اطلاعات علمی انستیتوتحقیقات ماهیان خاویاري دکتر دادمان بخاطر همکاري مستمر در طول انجام این تحقیق تشکر و قدردانی می گردد.
