بخشی از مقاله
چکیده
تولید گامتهای زنوژنیک گونههای ماهیهای دریایی مهم و دارای بدن بزرگ، که با گونههای ماهی میزبان کوچکتر بانسل کوتاه مدت درارای وابستگی نزدیک هستند ممکن است تولید تخم سریع و ساده از گونههای هدف را قادر سازد؛ همچنین با استفاده از ماهی قزلآلایرنگینکمان چند ویژگی منحصر به فرد از توسعهی سلول زایا را میتوان نشان داد، به این معنی که اسپرماتوگونی پیوند شده به داخل حفره صفاقی جنینی که تازه هچ شده است به سمت گیرندههای غدد، مهاجرت میکنند؛ که این اسپرماتوگونیها شروع به آووژنز و تولید تخمهای کاربردی میکند، در این راستا سلولهای زایای دیپلوئید پیوندشده به قزلآلای تریپلوئیدی میتواند گامتوژنز را کامل کند.
با ترکیب این ویژگیهای منحصر به فرد از سلولهای زایای ماهی، سیستمهای پیوندی آلوژنیک و زنوژنیک را برای اسپرماتوگونی در گونههای مختلف ماهی برقرار میکنیم. اسپرماتوگونی جدا شده از بیضهی بالغ - - - - GFP قزلآلایرنگینکمان ترانس-ژنیک، به داخل حفره صفاقی جنین تازه هچ شدهی قزلآلایماسوی تریپلوییدی، پیوند زده شده بود. این اسپرماتوگونی که با گسترش پای کاذب همراه است به سمت گیرندههای برآمدگی تناسلی قزلآلا مهاجرت میکند و پس از آن داخل آنها گنجانیده میشود. سلولهای اسپرماتوگونی گرفته شده، منتج به گامتوژنز و به ترتیب تولید اسپرم و تخمها در گیرندههای قزلآلای نر و ماده میشود.
در نتیجه، با تلقیح کردن تخمها و اسپرم، فقط اولین نسل فرزندی - F1 - قزلآلایرنگینکمان را به دست میآوریم، این نشان میدهد که قزلآلاهای تریپلوئیدی گیرنده، فقط گامتهای کاربردی مشتق شده از رنگینکمان دهنده را تولید کرده است. این پیوند درون صفاقی سلولهای زایا، در چندین ماهی دریایی قابل اجرا است، که میتواند در تولید تنماهی بلوفین سودمند باشد که مولدین بزرگ آنها بیش از100 کیلوگرم وزن دارند که برای نگهداشتن در شرایط پرورشی دشوار است. تولید گامت از تنماهیبلوفین میتواند به راحتی توسط تولید گونههای جایگزین به دست آید، مانند ماهی خال مخالی - ماکرل - ، که میتواند گامتهای تنماهی را تولید کند.
مقدمه
اخیراً محققین ژاپنی روشی برای ایجاد مولدین قزل آلای ماسو - Oncorhynchus masou - محقق کردهاند که هر دو تخم و اسپرم قزلآلایرنگینکمان - Oncorhynchus mykiss - را تولید میکند و در منتج شدن فرزندان جمعیت قزلآلایرنگینکمان از طریق لقاح با استفاده از این تخمها و اسپرم موفقیتآمیز بوده است - اوکوتسو و همکاران. . - 2007 این فنآوری احتمال کاربرد گوناگون در زمینه بیوتکنولوژی ماهی را دارد. برای مثال، تنماهیبلوفین اقیانوس آرام - Thunnus orientalis - ، که یکی از با ارزش ترین ماهیان تجاری است، 3تا5سال برای رسیدن به بلوغ جنسی طول میکشد، که در آن زمان وزن بدن به بیش از 100کیلوگرم میرسد - ناگاساوا و همکاران. . - 2009 در نتیجه، تولید گامت برای این گونهها از نظر زمان، هزینه و نیروی انسانی پرخرج است و نیاز به قفس توری شناور با قطر40 تا80 متر جهت حفظ ماهیان بالغ دارد.
با این حال، اگر اسپرماتوگونی تنماهیبلوفین اقیانوس آرام را بتوان با دقت درون ماهی چوبماکرل - Scomber japonicus - که گونهی نزدیک به بلوفین است پیوند زد، به طوریکه بلوغ جنسی در 1 سال در وزن بدنی کمتر از500 گرم برسد، گامتهای تن ماهی بلوفین اقیانوس آرام میتواند حتی در یک مخزن زمینی کوچک ماهی راحتتر و با سرعت بیشتری تولید شود. همچنین با این روش امکان تولید تخم و اسپرم گونههای رو به انقراض وجود دارد، مانند ماهیان خاویاری، که حدأقل 10سال طول میکشد تا به بلوغ برسد؛ دقاًی در گونههای ماهی نزدیک به این گونهها بلوغ در یک دورهی کوتاهتری است.
اصل این تکنولوژی ساده است، همانطور که در شکل1 نشان داده شده است. سلول های مولد تخم و اسپرم از گونههای هدف جدا شده و به گونههای گیرنده، پیوند زده شدهاند؛ که نتیجه آن تولید تخم و اسپرم در گونه گیرنده می باشد. با این حال، برای یک فنآوری موفقیتآمیز لازم است تا چندین خواص کلیدی بیولوژیکی ماهی ترکیب شود. در این بررسی، این خواص را معرفی میکنیم؛ مختصری هم درمورد چگونگی جایگزینی قزلآلایماسو خواهیم گفت و بیان میکنیم که چگونه توسط این ماهی، فقط فرزندان قزلآلایرنگینکمان را تولید میکنیم.
جنین تازه هچشده فاقد سیستم کامل ایمنی است
وقتیکه سلولهای زندهی گونههای دیگر به ماهی گیرنده پیوند زده میشود، اولین مانع برای رد سلولهای پیوندزدهشده، توسط سیستم ایمنی گیرنده است. در بسیاری از گونههای جانوری، تیموس و سلولهایT برای یک بازهی زمانی طولانی، تا زمان پیشرفتهای توسعه جنینی تمایز نیافته باقی میماند. در واقع، در آزادماهیان تقریبا به مدت 2 هفته پس از هچشدن تخم طول میکشد تا سیستم ایمنی یه بلوغ برسد، که در طول این مدت آنها فاقد توانایی ردکردن سلولهای خارجی هستند بنابراین فرض کردیم که پیوند سلولهای زایای اولیه قزلآلایرنگینکمان - PGCs - توسط قزلآلایماسوی تازه از تخم در آمده رد نمیشود. با این حال، غدد تناسلی بسیار کوچک جنین ماهیقزلآلا - طول بدن در حدود 1,3 سانتی متر است - به عنوان چالشی دیگر معرفی شده است؛ که این محققین پیوند PGC را با استفاده از یک میکروکنترلکننده شروع کردند؛ بنابراین آنها بر روی توانایی واقعی منحصر به فرد PGCهای خود متمرکز شدند.
اصل تولید تخم و اسپرم از گونههای مختلف در والدین جایگزین با استفاده از پیوند سلول زایا
سلولهای زایا میتوانند در بیرون بگردند و به سمت گنادهای جنسی مهاجرت کنند غدد جنسی، منشاء فرم نخستین تمام حیوانات در طول رشد جنین است که فقط متشکل از سلولهای سوماتیک میباشد. PGCهایی که در خارج از گنادها مشخص شدهاند، به دنبال موقعیت منشاء غدد تناسلی و مهاجرت به آنجا توسط کموتاکسیز با استفاده از پای کاذب میباشند راز، . - 2004 بر اساس این دانش، فرض میکنیم که اگر PGCها را در مجاورت گنادهای قزلآلای ماسو پیوند زدیم، آنها به سمت گنادها مهاجرت کرده و داخل آنها جاداده میشوند. در واقع، محققین نشان دادند که پیوندPGCها از ترکیب دهندههای جنسی به داخل حفره صفاقی جنین دریافتکنندهی تازه هچشده گرفته شده است - شکل - 2؛ که منجر به مهاجرت و ترکیب آنها به داخل غدد گیرنده در هر دو جنس میشود - تاکه اوچی وهمکاران. 2003 و . - 2004 آنها متوجه شدند که PGCهایی که از قزلآلایرنگینکمان گرفته شده بودند خیلی زیاد شدند و درون گنادهای قزلآلایماسو شروع به تمایز کردند؛ برخی از نرهای گیرندهی قزلآلا رشد میکنند تا پس از یکسال تمام به بلوغ برسند.
همانطور که سلولهای زایای دهنده از ترانسژنیک قزلآلایرنگینکمان حامل ژن GFP که تحت کنترل سلول خاص زایای پیش برندهیvasa است را آماده میکنیم - یوشیزاکی و همکاران.2000؛ تاکه اوچی و همکاران. - 2002، قادر به استفاده از تجزیه و تحلیل PCR با استفاده از پرایمرهای ژن خاصGFP برای تعیین اینکه چه اسپرمی در آزادماهی دریافتکننده قزلآلای رنگینکمان را در برگرفته است خواهیم بود. نتایج نشان داده است که 5 تا از 37 آزادماهی تولید شده نتیجه دهندهی اسپرم قزلآلا میباشند - تاکهاوچی و همکاران.. - 2004 پس از آن، یک آزمون نتاج، شامل تلقیح مصنوعی اسپرم به داخل تخمهای طبیعی قزلآلایرنگینکمان انجام دادیم.
با این حال، پیشبینی کرده بودیم که حتی اگر اسپرم متعلق به این پنج عدد ماهی از اسپرم قزلآلا تشکیل شده باشد، بازهم آن حاوی مقادیر زیادی از اسپرز سالمونماهی باشد . این به ایجاد دورگههایی که از باروری تخمهای قزلآلایرنگینکمان با اسپرم قزلآلایماسو در داخل اسپرز سالمونماهیگیرنده حاصل شدهاند، منجر میشود. انتظار میرود که هچشدن تخم هیبرید با تأخیر انجام شود، همچنین جنینها پس از خروج از تخم فوراً بمیرند. در مقابل، پیشبینی میشود که لقاح تخمهای قزلآلا با اسپرم قزلآلا در اسپرز سالمونماهیگیرنده، جنینهای طبیعی قزلآلایرنگینکمان را تولید کند.
در واقع اگر چه بسیاری از افراد دورگه همراه با تأخیر در هچشدن بودند، به طور معمول 0,4 از افراد نسل F1دقیقاً همان زمانی که معمول قزلآلایرنگینکمان است هچ شدند . تجزیه و تحلیل PCR نشان داد که این نوزادانی که ژنهای رگهایGFP را حمل میکنند، وارد قزلآلای دهنده شده اند. علاوه بر این، PGCها، از رگهایGFP مثبت نوزادان، فلورسانس سبز ساطع کردهاند. بنابراین به این نتیجه رسیدهایم که نوزادان از قزلآلایرنگینکمان بودند؛ همچنین اسپرم قزلآلایرنگینکمان توسط قزلآلایماسوی نر از PGCهای پیوندزده شدهی قزلآلا تولید شده است - تاکهاوچی و همکاران. . - 2004 با این حال، دو مشکل باقی مانده است: اول این بود که سالمون گیرنده، تخمهای قزلآلای گرفته شده را نمی تواند تولید کند، و دوم این که اسپرم قزلآلای تولید شده توسط سالمون برای کمتر از 0,4 اسپرمها گزارش شده بود. برای غلبه بر این مشکلات، تلاش کردیم تا از سلولهای اسپرماتوگونی استفاده کنیم.
ریزتزریق سلولهای زایا به داخل حفرهی صفاقی جنینهای تازه هچشده
اسپرماتوگونی ماهیان بالغ میتواند گنادهای جنینی را تحت تسلط درآورد
غالباً در جریان آزمایشهای پیوندPGC، دشوار است که PGCهایکافی به دست آوریم؛ زیرا این سلولها تنها در مراحل هچشدن جنین یافت میشوند. بهعنوان مثال، جنینهای متعلق به قزلآلایرنگینکمان، دارای تعداد بسیار کمی هستند - حدود 50تا - 100 - ناگلر و همکاران. . - 2011 علاوه بر این، در هر ماهی تنها20 تاPGC 30 میتوان از طریق درمان آنزیمی جدا کرد. در آزمایشهای پیوندی که در بالا ذکر شد، تعداد زیادی از جنینهای هچشده را نیاز داریم تا10 تاPGC 20 به یک گیرنده پیوند بزنیم. این مشکلات برای کاربرد در گونههای با ارزش تجاری مطرح میشود مانند تنماهیبلوفین، در مقایسه با ماهیان پرورشی مانند قزلآلایرنگینکمان. بنابراین بر ایجاد اسپرماتوگونی فراوان در بافت بیضه نرها، بدون در نظر گرفتن سن و چرخه تولید مثل تمرکز میکنیم.
