مقاله زیست مانی درون شیشه ای کالوس های زرشک بیدانه ( . Berberis vulgars L )

بخشی از مقاله

چکیده:

زرشک با نام علمی - Berberis vulgaris var. asperma - از تیره ی زرشک - Berberidaceae - می باشد که به دلیل وجود مواد فنولی فراوان در کشت درون شیشه زرشک، قدرت زیست مانی کالوس ها پایین بوده و سریع نکروزه و ازبین می روند.در این تحقیق عوامل موثر بر افزایش قدرت زیست مانی کالوس زرشک بی دانه درفصل بهار بررسی شد. برگ های جوان به عنوان ریزنمونه مورد استفاده قرار گرفتند .محیط کشت MS/2 به میزان 17/215گرم بر لیتر به همراه 8گرم آگار و میزان 1میلی لیتر آسکوربیک اسید و2ترکیب هورمونی 2-4-DوBAP به میزان یک لیترباPH=8تهیه شد. پس از22روز ریزنمونه ها شروع به کالوس زایی کردند.به مدت یک ماه بعد از تشکیل کالوس واکشتی صورت نگرفت وریزنمونه ها نکروزه شدند وپس از اولین واکشت کالوس های نکروزه شده شروع به رشد مجددکردند. نتایج نشان داد، بهترین تیمار جهت القاءکالوس، محیط کشت MS/2حاوی 0/5میلی گرم در لیتر 2-4-D و2میلی گرم در لیترBAP بود ،کالوس ها دارای رنگ روشن تر و ساختارتوده ای مشخص بودند و قدرت زیست مانی کالوس ها% 89,7 بود.

کلید واژه: پلی فنولی،واکشت،BAP،آسکوربیک اسید

.1مقدمه:

زرشک با نام علمی - Berberis vulgaris var. asperma - از تیره ی زرشک - Berberidaceae - ، درختچه ایست خاردار که بعضاً بصورت وحشی اما دانه دار در دامنه های کوه های البرز و سایر نقاط کشور دیده شده است. زرشک قاینات که به نام یاقوت سرخ مشهور است از نوع بی دانه بوده که ارتفاع بوته آن تا2مترنیز می رسد. برگهای آن بیضی شکل و دندانه دار است که این برگها به صورت دسته ای در کنار تیغه ها می رویند. محصول آن بر روی شاخه های یکساله و باروری آن بصورت یک سال در میان است. در کشور ما زرشک از جمله درختچه های مقاومی است که قابلیت رشد و تولید در زمینهای کم بهره با آب شور را داراست و توجه بیشتر به آن، ضمن بالا بردن ظرفیت تولید محصولات کشاورزی، در حفاظت از خاک منطقه نیز می تواند موثر باشد .[9]

زمین های جنوب خراسان به دلیل شوری خاک و آب برای کشت اغلب محصولات کشاورزی مناسب نیستند، لذا در این مناطق و بویژه طی 20سال اخیر زرشک بی دانه به عنوان محصول اصلی مطرح شده، بطوریکه بیش از 95درصد سطح زیر کشت و تولید زرشک درکشور را به خود اختصاص داده است[2]و . [5 ] تولید زرشک در خراسان جنوبی سالانه بیش از 8400تن بوده که از سطح 6442 هکتار اراضی باغی به دست می آید .[12] میوه زرشک طبیعتی سرد و خشک دارد و درطب سنتی مقوی کبد و قلب، صفرابر، مسکن حرارت معده و بندآورنده سیلان خون و بواسیر است، همچنین از خونریزی مزمن جلوگیری می کند.از برگ زرشک به تنهایی یا مخلوط با داروهای مناسب برای زخم روده ها ونیز رفع اسهال های ناشی از ضعف امعاء و احشای داخل شکم استفاده می شود.[13]

زرشک ازطریق قلمه و پا جوش تکثیر می شود و به دلیل بی دانه بودن گیاه نمی توان از طریق بذر تولید و تکثیر نمود .کشت درون شیشه انعطافپذیری بالایی جهت فراهم کردن شرایط تکثیر گیاهان دارد. در این نوع کشت، میتوان با سرعت و در مقیاس وسیع و اقتصادی ، نهالهای مورد نیاز جهت انتقال به مزرعه را تولید کرد [3]و.[6]کشت این ویترو1 شامل مجموعه روشهای آزمایشگاهیاست که با تکیه برخاصیت پرتوانی2 از یک اندام ، بافت و یا حتی پروتوپلاست ، گیاهیکامل و منطبق برهدف مورد نظر را تولید میکند[1] و.[8] گیاهان درون شیشه واکنش های متفاوتی نشان می دهند ؛ تاجایی که ممکن است منجر به از بین رفتن و زوال سلول ها شود از این رو لازم است که میزان زیست مانی کالوس3 ها درسطوح مختلف بررسی شود.[4]

کشت بافت گیاهان چوبی به ویژه آن دسته از گیاهان چوبی که دارای مقادیر زیادی مواد فنولی میباشند به دلیل ترشح این مواد و درنتیجه مرگ سلولی ریز نمونه دشوار میباشد.[16]درپدیده ی قهوه ای شدن مجموعه ای ازعواملی مانند، نوع و غلظت هورمون، نوع محیط کشت، ژنوتیپ، نوع ریزنمونه، مکان جغرافیایی که ریزنمونه از آن تهیه شده، نوع ماده و مدت زمان استریل کردن سطحی، فصل جمع آوری ریزنمونه و نوع ماده جامد کننده محیط کشت ،هریک به تنهایی و یا ترکیبی از آنها می تواند نقش داشته باشد.[14][11] بیان کردند وجود سطوح بالایی از هورمون BAP در کشت بافت گلابی به ویژه در زمانی که از محیط کشت های MS با غلظت های کم عناصر استفاده شود موجب تشدید قهوه ای شدن و در نتیجه از بین رفتن ریزنمونه ها می شود. [15]

اظهار داشت ، بیشترین مقدار قهوه ای شدن در غلظت های بالای هیپوکلرید سدیم اتفاق می افتد. [10] نشان داد در ریزنمونه برگ آنتوریوم یشترین درصد زنده مانی - %58 - در ترکیب هورمونی 2میلی گرم بر لیتر BAدرترکیب با 0.5 میلی گرم در لیتر-2-4 D رخ می دهد و در ریزنمونه دمبرگ آنتوریوم بیشترین درصد کالوس زایی - - %90 و بیشترین درصد زنده مانی - %95 - مشاهده شد.به دلیل وجود مواد فنولی فراوان در کشت درون شیشه زرشک، قدرت زیست مانی کالوس ها پایین بوده و سریع نکروزه و ازبین می روند. لذا هدف از این آزمایش بررسی عوامل موثربر قدرت زیست مانی و رشد کالوس زرشک می باشد.

.2ابزار و روش ها:

در این آزمایش نمونه برداری در اردیبهشت ماه 1396 از شاخه های جوان زرشک موجود در باغ دانشکده کشاورزی دانشگاه بیرجند واقع در 6 کیلومتری جاده بیرجند-کرمان، با عرض جغرافیایی 32° 56´ شمالی و طول جغرافیایی59° 13´ شرقی در ارتفاع 1480 متری از سطح دریا، صورت گرفت. شاخه های جوان به مدت 24ساعت در داخل آب قرار گرفتند. برگ های جوان به عنوان ریزنمونه مورد استفاده قرار گرفتند ،برگ ها پس از انتقال به آزمایشگاه به مدت 2دقیقه در زیر آب جاری قرارگرفتندو ادامه کارضدعفونی در زیر هودلامینار انجام گرفت. مراحل ضدعفونی بدین صورت بود که برگ ها به مدت 7دقیقه بامحلول هیپوکلریت سدیم %1 وپنج قطره تویین %20 ضدعفونی شدند و سپس 3 بار با آب مقطر استریل هر بار به مدت 3 دقیقه آب کشی شدند.سپس ریزنمونه ها به یک شیشه ی استیل انتقال داده شدند.محیط کشت شامل:محیط کشت MS/2 به میزان17,215گرم بر لیتر به همراه 8گرم آگار و میزان 1میلی لیتر آسکوربیک اسید و2ترکیب هورمونی 2-4-DوBAP به میزان یک لیترباPH=8تهیه شد.ریزنمونه های برگی بعد از برش به شیشه های حاوی ترکیبات هورمونی زیر انتقال یافتند.

تیمارهای هورمونی

1- MS/2+ 0 mg/l 2-4 -D + 0 mg/l BAP 2-  MS/2+ 0 mg/l 2-4-D + 1 mg/l BAP 3-  MS/2+ 0 .5 mg/l 2 -4-D + 2 mg/l BAP 4-  MS/2+ 1 mg/l 2-4-D + 0 mg/l BAP 5-  MS/2+ 2 mg/l 2-4-D + 0 mg/l BAP 6-  MS/2+ 1 mg/l 2-4-D + 1 mg/l BAP 7-  MS/2+ 1 mg/l 2-4-D + 2 mg/l BAP 8-  MS/2+ 2 mg/l 2-4-D + 1 mg/l BAP 9-  MS/2+ 2 mg/l 2-4-D + 2 mg/l BAP
جدول-1تیمارهای هورمونیبعد از انتقال ریزنمونه ها به محیط کشت ، شیشه های حاوی محیط کشت به داخل انکوباتور با دمای 25±2 درجه سانتی گراد و درتاریکی مطلق انتقال یافتند.پس از22روز ریز نمونه ها شروع به کالوس زایی کردند. به مدت یک ماه بعد از تشکیل کالوس واکشتی صورت نگرفت و ریزنمونه ها نکروزه شدند و پس از اولین واکشت کالوس های نکروزه شده شروع به رشد مجددکردند.

.3روش آماری وتجزیه ی داده ها:

آزمایش در قالب طرح کاملا تصادفی با 4 تکرار انجام شد. فاکتورهای آزمایش شامل ترکیبات هورمونی - 2-4-D و - BAP و زیست مانی کالوس ها بودند.کاربرد مواد بازدارنده ی قهوه ای شدن: قراردادن قلمه هادرآب 2 - ساعت،24ساعت - ،آسکوربیک اسید - %10، - 0 ، شست وشو - باآب ، با الکل - ، واکشت - هردوهفته یک بار و هریک ماه یک بار - .تجزیه و تحلیل داده ها بر اساس وزن تر کالوس ها و میزان زیست مانی کالوس ها انجام شد. .تجزیه واریانس و مقایسه میانگین ها با استفاده از نرم افزار SAS و مقایسه میانگین با آزمون دانکن درسطح %5 انجام گرفت و برای رسم نمودارها از نرم افزار Excel 2013 استفاده شد.

نتایج:

کالوس زایی:ازمحیط های متفاوتی جهت القاء کالوس استفاده شد. القاءکالوس درمحیط کشت MS/2حاوی 0/5میلی گرم در لیتر 2-4-D و2میلی گرم در لیترBAP درهمه ی تکرارها موفقیت آمیز بود،کالوس هادارای رنگ روشن ترو ساختارتوده ای مشخص بودند. - نمودار - 2