بخشی از مقاله
چکیده
تاکسول ترکیبی دیترپنوئیدی است که نخست از درخت سرخدار و بعدها از درخت فندق جداسازی شد. گیاه فندق از خانواده Betulaceae و از جنس Corylus است. TDAT آنزیم کلیدی در مسیر تاکسول میباشد که سومین مرحله در بیوسنتز تاکسول را کاتالیز میکند. بهمنظور شناسایی این ژن، DNA ژنومی از کالوس استخراج و بهعنوان الگو جهت PCR استفاده شد. توالیهای EST فندق همردیف شدند و یک توالی توافقی بدست آمد. فرآورده حاصل از PCR تخلیص و توالی یابی شد. نتایج بیانگر وجود ژن TDAT میباشد و مقایسه توالیها نشان داد TDAT با ژن HHT در گردو ایرانی 84 درصد یکسانی دارد.
.1 مقدمه
فندق گیاهی است از خانواده Betulaceae و از جنس Corylus که تاکنون 25 گونه مختلف آن در دنیا شناسایی شده است که بهطور وسیع در مناطق معتدل دنیا پخش شدهاند و از این 25 گونه تنها 9 گونه ازنظر اقتصادی و برنامه به نژادی حائز اهمیت میباشند .[10] منشأ اصلی فندق در ایران مشخص نیست. هرچند رویشگاه اصلی آن در منطقه حیران تا دنیاچال در استان گیلان قرار دارد ولی عمده مناطق فندق کاری در ایران به حاشیه دریای خزر و نواحی کوهستانی محدود میشود
فندقهای ایران از گونه Corylus avellana L. میباشند .[1] اولین گزارش مبنی بر وجود تاکسول در فندق متعلق به Hoffman میباشد. اگرچه که مقدار تاکسول در هر گرم از شاخه و برگ فندق در حدود 5 میکروگرم میباشد اما به دلیل رشد سریع و توزیع وسیع، این گیاه بهعنوان منبعی از تاکسول قابلتوجه میباشد
تاکسول یا پا کلی تاکسل یک دیترپنوئید با ساختار شیمیایی بسیار پیچیده و یکی از مؤثرترین داروهای ضد سرطان است که اولین بار از درخت سرخدار و پس از آن از درختانی مانند فندق جداسازی شدند. این ترکیب و محصولات یا پیش مادههای جزو تاکسان ها و یا دقیقتر تاکسوئیدها میباشند. تاکسول امروزه بهعنوان یکی از محبوبترین داروها در شیمیدرمانی مورداستفاده قرار میگیرد
در برابر طیف وسیعی از انواع تومورها ازجمله سرطان سینه، رحم و معده مؤثر است. باوجودآنکه بسیاری از داروهای ضد سرطان که امروزه در دسترس هستند، از عوارض جانبی بالایی برخوردار بوده و درعینحال و در برابر تعداد زیادی از سرطانها مؤثر نیستند، تاکسول در مقایسه با دیگر ترکیبات مشابه بر روی سلولهای سرطانی اثر منحصربهفردی دارد
در مسیر تولید تاکسول، نخستین پیش ماده اصلی تاکسادین است که با حلقوی شدن 1GGPP تشکیل میشود.آنزیم درگیر در این مسیر تاکسادین سنتاز 2 - TS - است .[11] پیشنهاد شد که هیدروکسیلاسیون تاکسادین در موقعیت C-5 توسط تاکسادین 5 هیدروکسیلاز3 صورت میگیرد و تاکسادینول تولید میشود
استیله کردن آنزیم تاکسادینB5 Bاول بهعنوان سومین مرحله بیوسنتز تاکسول در کربن پنج - C5 - توسط آنزیم - TDAT - Taxadien-5 -ol -O- acetyltransferase صورت میگیرد. تاکسادین- -5اول و استیل CoA پیش مادههای آنزیم TDAT میباشند. آنزیم TDAT برای تبدیل تاکسادین--5اول به تاکسادین- -5اول–استات با آنزیم 7D[DGLHQ 13 - K\GUR[\ODVH - 7 + - رقابت میکند که مسیر بعد از آنزیم 7 + مشخص نیست.
با توجه به اهمیت اقتصادی بالای تاکسول، شناخت مسیرهای بیوسنتزی آن در فندق، بهمنظور شناخت نحوه بیان ژنهای درگیر و رفع محدودیتهای موجود در آن، بسیار مهم است. جداسازی و توالی یابی ژن TDAT، مرحله کلیدی در تحقیقات در رابطه با شناسایی یک ژن، بیان آن، عملکرد، ساختار و برهمکنش پروتئین با پروتئین است.
.2 مواد و روشها
نمونه گیاهی مورد استفاده در این پژوهش کالوس فندق - Corylus avellana L. - بود به طریقه کشت درون شیشهای4 از لپههای فندق تازه تهیهشده از باغات شمال کشور منطقه اشکورات - رودسر - میباشد. جهت تولید کالوس ابتدا پوسته چوبی بذور فندق حذف و سپس آنها را با آب حاوی چند قطره مایع ظرفشویی شسته و در مرحله بعد به ترتیب در محلول هیپوکلریت سدیم تجاری 5/25 - درصد - به مدت 20 min ، سپس در آب مقطر استریل به مدت 5 min و سپس در الکل 70 درصد به مدت 2 sو مجدداً در محلول هیپوکلریت سدیم تجاری به مدت 20 min قرار داده شدند.
از این مرحله بذور به زیر هود لامنیار استریل منتقلشده و 3 مرتبه آبکشی با آب مقطر استریل انجام شد. درنهایت بذور روی کاغذ صافی استریل قرار گرفتند تا خشکشده و کشت در محیط کشت MS حاوی 2 mg l -1 از 2,4-D و 0/2 mg l -1 از BAP به همراه g l-301 ساکاروز و 6/75 g l-1 آگار استفاده شد. کالوسها در ظروف شیشهای و یا در پتری دیشهای یکبارمصرف با طول cm 9 در دمای 25 0C نگهداری و تولید شدند. بعد از گذشت21 روز کالوسها ظاهر شدند.
استخراج DNA از کالوسهایی که در محیط جامد رشد کردند، به روشهای سقایی معروف [7]، Zhang و همکاران [13] و روش Cai و همکاران [2] انجام شد.
پس از استخراج، کیفیت و کمیت DNA توسط دستگاه نانودراپ و از طریق الکتروفورز روی ژن آگارز %1 بررسی گردید. سپس نمونههای DNA در فریز -20 0C نگهداری شدند.
برای طراحی پرایمر جهت جداسازی ژن موردنظر، از توالیهای EST موجود در پایگاه اطلاعاتی NCBI استفاده شد. سپس این توالیها توسط برنامه Codon Code Aligner سرهم سازی شدند و یک توالی توافقی حاصل گردید. برای ترجمه توالی توافقی به چهارچوب قرائت باز از برنامه آنلاین ORF Finder استفاده شد که دارای طول 1190 bp می باشد.بهمنظور جداسازی ژن موردنظر 8 جفت آغازگر طراحی گردید که از این میان 2 آغازگر مناسب انتخاب گردید - جدول . - 1 آغازگر رفت و آغازگر برگشت در خارج از ناحیه ORF طراحی گردیدند - . - Fr1, Rr1 با طراحی آغازگرهایی در خارج ORF ، علاوه بر جداسازی ناحیه کد کننده ژن TDAT ، قطعاتی با طول بیشتر علاوه بر ژن موردنظر حاوی توالیهای بالادست و پاییندست آن نیز میباشند، جداسازی گردیدند.
جهت آزمودن، تأیید و بهینهسازی شرایط موردنیاز برای PCR و انتخاب آغازگر مناسب از بین آغازگرهای طراحیشده، واکنش زنجیرهای پلی مراز در چندین تکرار انجام شد بررسی این واکنش برای انجام مراحل بعدی ازجمله شناسایی ژن از طریق آغازگرهای طراحیشده لازم و ضروری است. سیکل دمایی واکنش شامل یک مرحله واسرشت سازی ابتدایی با دمای 94 درجه به مدت 3 دقیقه، 34 سیکل واسرشت در دمای 94 درجه به مدت 30 ثانیه ،اتصال در دمای 53 درجه به مدت 35 ثانیه و بسط در دمای 72به مدت 90 ثانیه انجام شد.
واکنش PCR در حجم نهایی 25 ʽl با موادی به مقادیر 2 ʽl برای DNA ، 1 ʽl از هرکدام یک از آغازگرهای رقت و برگشت با غلظت 10 pmol. ʽl -1 و12/5 ʽl از Master mix PCR - 2X - صورت پذیرفت. محصول PCR از طریق الکتروفورز روی ژل آگارز %1 بررسی شد. مجتمع سازی1 و ویرایش نواحی همپوشان conting قطعات توالی یابی شده با استفاده از نرمافزار CLC Sequencing Version 6.1 صورت گرفت
جدول 1 مشخصات آغازگرهای طراحیشده برای شناسایی ژن TDAT
.3نتایج و بحث
از روشهای سقایی معروف ، Zhang و Cai برای استخراج DNA استفاده شد اما کیفیت و کمیت DNA استخراجشده از طریق روشهای سقایی معروف و Zhang بسیار پایین بوده است. میزان جذب نور در طولموج 260 نانومتر میزان اسیدنوکلئیک نشان میدهد که در روش سقایی معروف برابر 7/4 و در روش Zhang برابر 15 و در روش Cai برابر 135/4 نانوگرم میباشد و همچنین کمترین آلودگی پروتئینی/ فنلی و الکلی در روش Cai مشاهده گردید. کیفیت روش های استخراجی از طریق الکتروفورز بر روی ژل آگارز بررسی گردید وتنها روش Cai دارای باند شفاف و بدون شکست بود که نشان دهنده کیفیت بالا این روش در استخراج DNA از کالوس فندق می باشد
در استخراج DNA از گیاهان دارویی توجه به ترشحات فنولی برای استخراجی با کیفیت بالا برای انجام سایر مراحل مهندسی ژنتیک بسیار ضروری است DNA .[8] استخراج شده توسط روش Cai به عنوان الگو در واکنش PCR با استفاده از آغازگرهای Fr1 وRr1 استفاده شد. این آزمون به منظور شناسایی وجود یا عدم وجود ژن TDAT در سطح DNA ژنومی قبل از انجام فرآیندهای وقت گیر و هزینه بر استخراج RNA و ساخت cDNA انجام پذیرفت. قطعه حدود 1600 bp تکثیر شده در این واکنش به طور مقدماتی تعیین ترادف شد و میزان همولوژی آن با توالی توافقی بدست آمده بررسی گردید و این دو توالی همسانی 98 درصدی را نشان دادند که نشان دهنده این است که ژن TDAT در سطح DNA وجود دارد.
طول ناحیه تکثیر شده توسط آغازگرهای Fr1 وRr1 باید1423 bp باشد اما باند 1600 bp بر روی ژل آگارز یک درصد مشاهده گردید. همسانی 98 درصدی توالی توافقی که طول آن 1423 bp بود با توالی که تعیین ترادف شد نشان دهنده این است نواحی اینترونی در خارج از ناحیه کد کننده در سطح DNA می باشد و این ترادف شامل توالی ORF که طوا آن 1190 bp است، می باشد - شکل . - 2 میزان همسانی ومشابهت توالی به دست آمده با سایر توالی های موجود در Gene Bank در سطح نوکلئوتیدی و پروتئینی بررسی گردید.
