بخشی از مقاله
چکیده
نانوذرات فلزاتی مانند نقره و طلا در طی سال هاي اخیر بدلیل کاربرد گسترده شان در زمینه هاي مختلفی مانند بیوتکنولوژي، بسته بندي مواد غذایی، پزشکی، الکترونیک، بهداشتی و آرایشی و پوشاك بسیار مورد توجه قرار گرفته اند. هدف در این تحقیق تاثیر ضد میکروبی نانوذرات نقره تولید شده توسط گلبرگ هاي زعفران بر مهمترین باکتري هاي آلوده سازنده محلول هاي نگهدارنده گل هاي شاخه بریده بود.
در این تحقیق ما توانستیم با استفاده از عصاره گلبرگ هاي زعفران - Crocus sativus - از محلول 5 میلی مولار نیترات نقره نانوذرات نقره تولید نماییم و سپس آن را در آزمایش هاي دیگر هم بعنوان عامل ضد میکروبی علیه باکتري ها و هم بعنوان یک جزء مهم محلول نگهدارنده در پس از برداشت گل هاي شاخه بریده بکار ببریم. تاثیر غلظتهاي 1:20، 1: 5، 2:1 نانوذرات نقره تولید شده به روش سبز حاصله از گلبرگ هاي زعفران و عصاره گلبرگهاي زعفران بر بازدارندگی رشد پنج جنس از مهمترین باکتري هاي Bacillus subtilus - ، Bacillus cereu، Acinetobacter، Pseudomonads fluorescens و - Pseudomonas aeruginosa آلوده سازنده محلول هاي نگهدارنده گل هاي شاخه بریده بررسی شد.
این آزمایش نیز بصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی و هر تیمار در چهار تکرار اجرا شد . نتایج نشان داد تاثیر هم نوع باکتري و هم نوع غلظت بکار گرفته شده بر میزان رشد باکتریها معنی دار شد. عصاره گلبرگ هاي زعفران در مقایسه با سایر غلظت هاي نانوذرات نقره ساخته شده داراي هیچ گونه اثر ضد باکتري نبوده اما غلظت هاي 1:5 و 1:20 داراي بیشترین اثر بازدارندگی بودند. بازدارندگی رشد در باکتریهاي گونه هاي گرم مثبت یعنی جنسهاي باسیلوس و اکتینوباکتر بطور معنی داري نسبت به دو گونه باکتري گرم منفی سودوموناس بیشتر است.
١- مقدمه
گل رز - Rosa hybrida - از مهمترین گل هاي شاخه بریده دنیا می باشد و تولید و صادرات آن از ارزش اقتصادي ویژه اي برخوردار است. در حال حاضر حدود 40 درصد کل گل هاي بریدنی در ایالات متحده را به خود اختصاص داده و در کشورهاي دیگر نیز اهمیت خاص خود را دارد. کوتاه بودن عمر گلجایی آن به دلیل کاهش هدایت آبی در ساقه هاي آن بوده کهمعمولاً با پژمردگی، خمیدگی گردن و عدم باز شدن گل ها همراه می باشد و پژوهش هاي زیادي براي حفظ کیفیت پس از برداشت آن انجام شده است
کاهش عمر گلجائی اغلب گل هاي شاخه بریده توسط تجمع باکتري هاي موجود در محلول هاي نگهدارنده تحت تاثیر قرار می گیرد. باکتري ها به داخل آوندهاي چوبی1 ساقه ها وارد شده و سبب بسته شدن آوندها و کاهش میزان جذب آب توسط گل هاي شاخه بریده می شوند. بررسی هاي مختلفی نشان داده اند که باکتري هاي جنسهاي Bacillus، Pseudomonas و Acenitobacter بیشترین نقش را در انسداد آوندي گل هاي شاخه بریده دارند
براي جلوگیري از ازدیاد باکتري هاي موجود در محلول هاي نگهدارنده از انواع ترکیبات ضد میکروبی مانند هیپوکلریت سدیم، نمک هاي فلزات مانند سولفات آلومینیوم و نیترات نقره و استرهاي کوئینولین - مانند 8-HQC و - 8-HQS بطور معمول استفاده می گرد
اخیرا اثرات ضد میکروبی نانوذرات نقره بویژه علیه طیف وسیعی از میکروارگانیسم هایی مانند باکتري ها، قارچ ها و ویروس ها توسط محققین مختلفی شناخته شده است
بنابراین در این تحقیق تاثیر ضد میکروبی نانوذرات نقره تولید شده توسط گلبرگ هاي زعفران بر مهمترین باکتري هاي آلوده سازنده محلول هاي نگهدارنده گل هاي شاخه بریده بررسی شد.
-2 مواد و روش ها
-1 تولید نانوذرات نقره با استفاده از گلبرگ هاي زعفران
نانوذرات نقره ساخته شده به روش سبز2 یا بیولوژیکی با استفاده از عصاره گلبرگ هاي زعفران از محلول نیترات نقره یک میلی مولار ساخته شدند. بطور اختصار دو گرم پودر گلبرگ ها به 100 میلی لیتر آب مقطر افزوده شده و سپس درون حمام آب گرم با دماي 65- 70 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه همرا با شیکرشدن قرار داده شدند. پس از خنک شدن مخلوط حاصله در دماي اتاق، مواد جوشانده شده با استفاده از کاغذ صافی واتمن شماره 40 فیلتر شده تا عصاره استخراجی بدست آید. رنگ این عصاره پس از صاف شدن سبز تیره بود و این عصاره براي تولید نانوذرات نقره در مراحل بعدي بکار برده شد
-1-2 نوع باکتري ها و محیط کشت
اثر ضد باکتریایی نانوذرات نقره تولید شده روي مهمترین باکتري هاي آلوده سازنده محلول هاي نگهداري گل هاي شاخه بریده مانند جنس باسیلوس - دو گونه Bacillus subtilus و - Bacillus cereu و Acinetobacter - بعنوان باکتري هاي گرم مثبت - و سودوموناس - دو گونه Pseudomonads fluorescens و - Pseudomonas aeruginosa بعنوان باکتري هاي گرم منفی در محیط کشت مولر هینتون آگار3 انجام گرفت. این محیط کشت مورد استفاده، در اندازه هاله عدم رشد و میزان نفوذ و انتشار مواد ضد میکروبی نقش به سزایی دارد. محیط کشت مولر هینتون آگار حاوي عصاره گوشت، آنزیم کازئین هیدرولاز و نشاسته می باشد که به عنوان محیط انتخابی به کار برده می شود.
-2-2 آزمون دیسک گذاري
براي کشت باکتري بر روي محیط کشت مولر هینتون آگار، ابتدا سوسپانسیون میکروبی تهیه گردید. براي این کار چند کلونی از میکروارگانیسم مورد نظر در لوله هاي استریل که حاوي 3 تا 5 میلی لیتر محیط کشت مولر هینتون آگار بوده، وارد شده و سوسپانسیون میکروبی استاندارد 0/5 مک فارلند تهیه شد. سپس لوله ها به مدت 24 ساعت در دماي اتاق قرار گرفتند.
در ادامه نمونه هاي میکروبی توسط سوآب هاي استریل بر روي سطح پلیت محیط کشت داده شدند، طوري که اطمینان حاصل شود که تمام سطح پلیت با باکتري ها تلقیح شده است. سپس به دیسک هاي بلانک استریل به قطر 6 میلی متر حدود 50 میکرو لیتر از نانوذرات نقره تولید شده که شامل غلظت هاي 2:1، 1:5 و 1:20 بوده آغشته شده و توسط پنس استریل روي پلیت هاي تهیه شده قرار گرفته و در 37 درجه سانتی گراد به مدت 24 ساعت انکوبه شدند. از 50 میکرو لیتر عصاره استخرج شده حاصله از گلبرگ هاي زعفران نیز بعنوان شاهد بر روي دیسک ها استفاده شد. پس از انکوباسیون پلیت هاي کشت شده مورد بررسی قرار گرفته و هاله هاي عدم رشد مشاهده شده در اطراف دیسک ها بر حسب میلی متر اندازه گیري شدند و بدین ترتیب با توجه به قطر هاله هاي مهار رشد، میزان فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره تولیدي ارزیابی گردید. انجام آزمون 3 بار تکرار شد.
-3-2 تجزیه و تحلیل آماري
این آزمایش نیز بصورت فاکتوریل در قالب طرح کاملاً تصادفی و هر تیمار در چهار تکرار اجرا شد. همچنان که اشاره شد دو فاکتور نوع باکتري 5 - گونه - و غلظت نانوذرات ساخته شده - چهار غلظت - استفاده شد. داده ها با ANOVA و با استفاده از نرم افزار SAS تجزیه شدند. آزمون چند دامنه اي دانکن براي تعیین معنی دار بودن تفاوت آماري میان میانگین تیمارها در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.
-3 نتایج و بحث
نتایج تجزیه واریانس این آزمایش نشان داد که تاثیر دو نوع فاکتور یعنی هم نوع باکتري و هم نوع غلظت بکار گرفته شده در سطح %1 بر میزان رشد باکتریها معنی دار شدند. در ضمن تاثیر متقابل این دو فاکتور نیز معنی دار شد - جدول . - 1 نمودار مقایسه میانگین هاله ي بازدارندگی رشد گونه هاي مختلف باکتري در شکل 1 و غلظتهاي مختلف نانوذرات نقره تولید شده توسط عصاره گلبرگ هاي زعفران در شکل 2 نشان داده شده اند.
جدول :1 تجزیه واریانس تاثیر بازدارندگی رشد چهار غلظت نانوذرات نقره تولید شده
